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上篇 生物化学实验方法和技术原理3

第一章 生物化学分离方法3

第一节 离心技术3

一、离心沉降速率影响因素3

二、沉降系数5

三、离心设备7

四、制备超离心法7

第二节 层析技术10

一、薄层层析10

三、凝胶层析11

二、聚酰胺薄膜层析11

四、离子交换层析13

五、亲和层析13

六、气相色谱15

七、高效液相色谱16

第三节 电泳技术16

一、影响电泳的主要因素17

二、常用电泳支持介质18

三、聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳19

四、连续密度梯度电泳20

五、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳21

八、毛细管电泳22

六、等电聚焦电泳22

七、双向凝胶电泳22

九、电泳新技术23

十、电泳相关技术24

第四节 膜分离技术28

一、膜的分类28

二、膜的性能29

三、膜的使用寿命30

四、膜的分离技术30

第二章 生物化学分析方法33

第一节 重量法33

第二节 化学法34

第三节 分光光度法35

第四节 酶法36

一、化学方法37

二、仪器方法37

第五节 色谱法37

第六节 主要生物物质分析38

一、碳水化合物分析38

二、核酸分析42

三、蛋白质分析44

第一节 生物化学制备方法的特点46

第二节 溶剂提取法46

第三章 生物化学制备方法46

第三节 沉淀法48

一、盐析法48

二、有机溶剂沉淀法49

三、非离子多聚物沉淀法49

第四节 浓缩与干燥49

第五节 超临界流体萃取50

第六节 萃取与相分离52

第七节 结晶53

第四章 生物化学代谢研究方法55

实验一 生化实验要求及基本实验设备知识61

中篇 生物化学实验61

第一单元 基础训练61

实验二 植物试材水分测定和干样制备63

实验三 高等植物材料丙酮粉的制备67

实验四 缓冲溶液的配制和氨基酸两性性测定69

实验五 分光光度计线性分辨范围测定73

第二单元 基本实验76

实验六 酶的基本性质76

实验七 转氨酶活性鉴定（薄层层析法）80

实验八 淀粉酶活力测定83

实验九 脲酶Km值测定86

实验十 蛋白质的水解和氨基酸的纸层析法分离90

实验十一 蛋白质的两性性质及等电点的测定93

实验十二 蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G-250法）95

实验十三 还原糖和总糖含量的测定（3,5－二硝基水杨酸比色法）97

实验十四 丙酮酸含量的测定100

实验十五 抗坏血酸含量测定（2,6－二氯酚靛酚法）102

第三单元 重点实验107

实验十六 脂肪含量的测定及高级脂肪酸组分分析（气相色谱法）107

实验十七 单核苷酸的离子交换柱层析分离110

实验十八 RuBP羧化酶－加氧酶的纯化114

实验十九 连续密度梯度电泳法测定蛋白质的分子质量及纯度117

实验二十 过氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳120

实验二十一 双向免疫扩散试验124

实验二十二 质粒DNA的提取、酶切及电泳鉴定127

实验二十三 高等植物DNA的提取和纯度鉴定131

实验二十四 酵母蛋白质和RNA的制备（稀碱法）133

实验二十五 酵母RNA的提制（浓盐法）136

实验二十六 多酚氧化酶的制备和化学性质139

第四单元 综合实验142

实验二十七 种子蛋白质系统分析142

实验二十八 果实菠萝蛋白酶的动力学测定150

实验二十九 苯丙氨酸解氨酶的纯化及活性测定156

第五单元 选择实验162

实验三十 蛋白质含量测定（双缩脲法）162

实验三十一 蛋白质含量测定法（Folin－酚法）164

实验三十二 紫外吸收法测定蛋白质含量166

实验三十三 还原糖含量的测定（Somogyi-Nelson比色法）168

实验三十四 可溶性总糖的测定（蒽酮比色法）171

实验三十五 可溶性总糖的测定（地衣酚－硫酸法）174

实验三十六 直链淀粉和支链淀粉的测定（双波长法）175

实验三十七 粗纤维的测定（酸性洗涤剂法）179

实验三十八 果胶质含量测定（重量法）180

实验三十九 1398中性蛋白酶活性的测定183

实验四十 谷物种子中赖氨酸含量的测定186

实验四十一 甲醛滴定法测定氨基氮188

实验四十二 醋酸纤维薄膜电泳分离核苷酸191

实验四十三 蛋白质脱盐（透析和凝胶过滤）193

实验四十四 叶绿素含量测定（分光光度法）197

实验四十五 质膜透性与抗旱性鉴定（连续升温电导法）200

下篇 附录207

一、实验室安全及防护知识207

二、Union Carbide各种型号透析管的渗透范围210

三、Sepctro por再生纤维素膜透析袋的数据210

四、纤维素酯膜透析袋的数据212

五、Amicon圆形超滤膜的规格和有效过滤面积的数据213

1．调整硫酸铵溶液饱和度计算表（25℃）214

七、硫酸铵饱和度的常用表214

六、Amicon圆形超滤膜的流速214

2．调整硫酸铵溶液饱和度计算表（0℃）215

3．调整硫酸铵溶液饱和度计算表（23℃）216

八、缓中溶液的配制方法217

1．氯化钾－盐酸缓冲液（0.05mol/L,pH1.0～2.2,25℃）217

2．甘氨酸－盐酸缓冲液（0.05mol/L,pH2.2～3.6,25℃）217

3．邻苯二甲酸氢钾－盐酸缓冲液（0.05mol/L,pH2.2～4.0,25℃）217

4．柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液（0.1mmol/L,pH3.0～6.2）218

5．磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液（pH2.6～7.6）218

6．乙酸－乙酸钠缓冲液（0.2mol/L,pH3.7～5.8,18℃）218

8．丁二酸－氢氧化钠缓冲液（0.05mol/L,pH3.8～6.0,25℃）219

7．二甲基戊二酸－氢氧化钠缓冲液（0.05mmol/L,pH3.2～7.6）219

9．邻苯二甲酸氢钾－氢氧化钠缓冲液（pH4.1～5.9,25℃）220

10．磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液（0.2mmol/L,pH5.8～8.0,25℃）220

11．磷酸二氢钾－氢氧化钠缓冲液（pH5.8～8.0）220

12．Tris-HCl缓冲液（0.05mmol/L,pH7～9）221

13．巴比妥－盐酸缓冲液（pH6.8～9.6,18℃）221

14．2,4,6－三甲基吡啶－盐酸缓冲液（pH6.4～8.3）221

15．硼砂－硼酸缓冲液（pH7.4～9.0）222

16．硼砂缓冲液（pH8.1～10.7,25℃）222

17．甘氨酸－氢氧化钠缓冲液（pH8.6～10.6,25℃）222

19．硼酸－氯化钾－氢氧化钠缓冲液（0.1mol/L,pH8.0～10.2）223

20．二乙醇胺－盐酸缓冲液（0.05mol/L,pH8.0～10.0,25℃）223

18．碳酸钠－碳酸氢钠缓冲液（0.1mmol/L,pH9.2～10.8）223

21．硼砂－氢氧化钠缓冲液（0.05mol/L硼酸根，pH9.3～10.1）224

22．磷酸氢二钠－氢氧化钠缓冲液（0.025mol/L,pH11.0～11.9，25℃）224

23．氯化钾－氢氧化钠缓冲液（0.05mmol/L,pH12.0～13.0,25℃）224

24．广范围缓冲液（pH2.6～12.0,18℃）225

25．离子强度恒定的缓冲液（pH2.0～12.0）225

26．酸度计标准缓冲溶液的配制226

九、凝胶数据表227

1．Sephadex G型交联葡聚糖凝胶的数据227

2．Sephadex G型交联葡聚糖凝胶溶胀所需时间228

3．琼脂糖凝胶的数据228

5．琼脂糖凝胶Bio-Gel A型的数据229

4．Superose的数据229

6．Bio-Gel P型凝胶的数据230

7．交联聚苯乙烯凝胶Bio-Beads S-X型的数据230

8．制备级Superdex凝胶过滤介质的数据231

9．聚乙烯醇型凝胶Toyopearl的数据231

10．各种凝胶所允许的最大操作压231

十、凝胶过滤用标准蛋白232

1．凝胶过滤用低分子质量标准的组成232

2．凝胶过滤用高分子质量标准的组成233

3．凝胶过滤用分子质量标准品233

十一、薄层层析分离各类物质常用的展层溶剂233

（一）核酸染色235

十四、电泳染色方法235

十二、各类物质常用的薄层显色剂235

十三、腐蚀性万能薄层显色剂235

（二）蛋白质染色237

（三）糖蛋白染色238

（四）脂蛋白染色239

（五）同工酶染色239

十五、实验误差与提高实验准确度的方法245

（一）实验误差245

（二）误差来源246

十六、常用仪器使用方法247

（一）恒温箱247

（三）电动离心机248

（二）电热恒温水浴248

（四）722型光栅分光光度计249

（五）751G型分光光度计250

（六）自动部分收集器251

（七）核酸蛋白检测仪253

（八）电子顶载天平253

（九）电子分析天平254

（十）pHS-3C型数字酸度计255

（十一）pHS-2型酸度计255

（十二）移液器的使用257