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第1章　实验前后的注意事项和行为准则1

1.1 实验过程中的注意事项1

1.1.1 实验前的注意事项1

1.1.2 实验中的注意事项4

1.1.3 实验后的注意事项6

1.2　实验室成员的基本素质与行为准则9

1.3　实验中的一些技巧及心得14

1.3.1 提取高质量的RNA的技巧14

1.3.2 细胞冻存及复苏16

1.3.3　稳定转染后的检测方法17

1.3.4　连接转化实验心得17

1.3.5 Western Blot19

参考文献21

第一部分　DNA相关的操作24

第2章　质粒DNA的相关实验24

2.1 质粒DNA的分离与纯化24

2.1.1 概述24

2.1.2 实验材料、仪器和试剂26

2.1.3 实验原理、操作步骤和实验要点27

2.2 DNA酶切与电泳分析32

2.2.1 概述32

2.2.2 实验材料、仪器和试剂34

2.2.3 实验原理、操作步骤和实验要点34

2.3　重组质粒的连接、转化及筛选37

2.3.1 概述37

2.3.2 实验材料、仪器和试剂40

2.3.3 实验原理、操作步骤和实验要点41

参考文献45

第3章　聚合酶链式反应47

3.1 标准PCR反应和扩增产物克隆47

3.1.1 概述47

3.1.2 实验材料、仪器和试剂52

3.1.3 实验原理、操作步骤和实验要点52

3.2 反转录PCR(RT-PCR)57

3.2.1　概述57

3.2.2 实验材料、仪器和试剂58

3.2.3 实验原理、操作步骤和实验要点58

3.3 出错PCR（致突变PCR）63

3.3.1 概述63

3.3.2 实验材料、仪器和试剂64

3.3.3 实验原理、操作步骤和实验要点65

3.4 基于重叠延伸PCR的DNA合成技术70

3.4.1 概述70

3.4.2 实验材料、仪器和试剂71

3.4.3 实验原理、操作步骤和实验要点72

参考文献74

第4章　限制性内切酶的特性及应用77

4.1 概述77

4.2　实验方案77

4.2.1 单限制性内切酶对单DNA样品的消化77

4.2.2 消化多个DNA样品78

4.2.3 多限制性内切酶消化DNA样品78

4.2.4 限制性内切酶对DNA的部分消化78

4.2.5 DNA的甲基化79

4.3　相关知识80

4.3.1 背景知识80

4.3.2　关键因素81

4.3.3 时间安排83

4.3.4　预期结果83

参考文献83

第5章　基因组DNA的提取85

5.1 动物组织基因组DNA的提取85

5.1.1 概述85

5.1.2 实验材料85

5.1.3 实验步骤85

5.1.4　关键因素86

5.1.5 常见问题86

5.1.6 所需时间86

5.1.7　本节溶液配制87

5.2　植物组织基因组DNA的提取87

5.2.1 基本方案——氯化铯离心法87

5.2.2 备选方案——CTAB法88

5.3 人白细胞DNA的提取90

5.3.1 概述90

5.3.2 实验材料90

5.3.3 实验步骤90

5.3.4　关键因素91

5.3.5 所需时间91

5.4　DNA琼脂糖凝胶电泳及回收91

5.4.1 琼脂糖凝胶分离DNA91

5.4.2 基本方案1——DNA电洗脱92

5.4.3　基本方案2——NA-45纸电泳法93

5.4.4　基本方案3——用低熔点琼脂糖凝胶分离DNA片段94

5.4.5 备选方案1——使用β-琼脂糖酶从低熔点琼脂糖中回收DNA94

5.4.6 备选方案2——用玻璃珠法从低熔点琼脂糖中回收DNA95

5.4.7　本节溶液配制95

5.5　非变性聚丙烯酰胺胶电泳及DNA回收96

5.5.1 基本方案96

5.5.2　备选方案——通过电洗脱从聚丙烯酰胺凝胶纯化片段98

参考文献98

第6章　分子探针及Southern杂交100

6.1　探针的种类及其选择100

6.1.1　探针的概念100

6.1.2　探针的种类及其选择100

6.2　探针标记物的种类及其选择104

6.2.1 核素标记物104

6.2.2　非放射性标记物104

6.3　探针标记方法及其选择105

6.3.1 双链DNA探针标记方法105

6.3.2 单链DNA探针标记方法109

6.3.3 末端标记DNA探针112

6.3.4　寡核苷酸探针标记方法112

6.3.5 RNA探针114

6.4　探针的纯化114

6.4.1 乙醇沉淀法114

6.4.2　Sephadex G-50柱层析法115

6.4.3　微柱离心法115

6.5　Southern杂交115

6.5.1 实验原理115

6.5.2　基因组Southern Blot步骤116

6.5.3 背景信息121

6.5.4　关键参数121

6.5.5 问题解决方法122

6.5.6　预期结果122

6.5.7 时间控制122

6.5.8 优化方案123

参考文献126

第7章　基因组DNA的突变分析128

7.1 概述128

7.2　实验方案128

7.2.1 PCR产物单链构象多态分析（PCR-single-strand Conformation Polymorphism,PCR-SSCP）129

7.2.2 PCR-异源双链构象分析法（PCR-heteroduplex Analysis,PCR-HA）130

7.2.3 PCR产物直接测序130

7.2.4 PCR-限制性片段长度多态性分析（PCR-restriction Fragment Length Polymorphism,PCR-RFLP）132

7.3 相关知识133

7.3.1 背景知识133

7.3.2 关键因素135

7.3.3 时间安排138

7.3.4　预期结果139

参考文献139

第二部分　RNA相关的操作142

第8章 RNA的提取和cDNA合成142

8.1 概述142

8.2　组织或细胞的总RNA提取143

8.2.1 细胞或者组织样品匀浆处理143

8.2.2 RNA的抽提143

8.2.3 RNA定量144

8.2.4 RNA凝胶电泳144

8.2.5　保温实验144

8.2.6　材料与试剂144

8.2.7 相关知识145

8.3　mRNA的分离与纯化146

8.3.1 装柱与平衡柱子146

8.3.2 柱上吸附poly(A+)RNA146

8.3.3 从柱中洗脱poly(A+)RNA146

8.3.4 Oligo(dT)-纤维素再生146

8.3.5　材料与试剂147

8.3.6 相关知识147

8.4 cDNA的合成147

8.4.1 cDNA第一链的合成147

8.4.2 cDNA第二链的合成148

8.4.3 cDNA合成产物定量分析149

8.4.4 cDNA合成产物电泳分析150

8.4.5　材料与试剂150

8.4.6　相关知识150

参考文献151

第9章　寻找差异表达基因方法——SSH法154

9.1 概述154

9.2　实验方案155

9.2.1 RNA提取和cDNA合成155

9.2.2　Rsa I酶切消化155

9.2.3　寡聚核苷酸接头（Adaptor）连接156

9.2.4 第一次消减杂交157

9.2.5 第二次消减杂交157

9.2.6　PCR扩增158

9.2.7 克隆消减cDNA文库159

9.3　材料与试剂160

9.3.1 试剂160

9.3.2　仪器设备161

9.4　相关知识161

9.4.1 背景知识161

9.4.2 关键因素162

9.4.3 时间安排162

9.4.4　预期结果162

参考文献163

第10章　全长基因的克隆——SMART技术165

10.1 概述165

10.2　实验方案166

10.2.1 第一链cDNA合成166

10.2.2 LD PCR扩增cDNA167

10.2.3 蛋白酶K的消化167

10.2.4　Sfi I酶切消化168

10.2.5 通过CHROMA SPIN-400使cDNA链分段168

10.2.6 连接cDNA到载体中169

10.2.7 细菌的培养170

10.2.8 滴定未扩增的文库170

10.2.9 测定重组率170

10.2.10 文库扩增171

10.2.11 滴定扩增文库171

10.3　材料与试剂172

10.3.1 试剂172

10.3.2　仪器设备172

10.4　相关知识173

10.4.1 背景知识173

10.4.2 关键因素173

10.4.3 时间安排174

10.4.4　预期结果174

参考文献174

第11章 Northern Blot技术176

11.1 概述176

11.2　实验方案176

11.2.1 经甲醛变性处理后进行的RNA电泳176

11.2.2 变性RNA在膜上的转移和固定177

11.2.3　探针标记178

11.2.4 杂交和放射自显影178

11.3　材料与试剂179

11.3.1 试剂179

11.3.2　仪器设备179

11.4　相关知识179

11.4.1 背景知识179

11.4.2 关键因素180

11.4.3 时间安排180

11.4.4　预期结果180

参考文献180

第12章　siRNA的应用182

12.1 概述182

12.2　实验方案183

12.2.1 siRNA设计183

12.2.2　转录模板制备184

12.2.3 dsRNA合成184

12.2.4 siRNA制备和纯化184

12.3　材料与试剂185

12.3.1 试剂185

12.3.2　仪器设备185

12.4　相关知识185

12.4.1 背景知识185

12.4.2 关键因素186

12.4.3 时间安排186

12.4.4　预期结果186

参考文献186

第13章　RNA酶保护实验188

13.1 概述188

13.2　实验方案188

13.2.1 制备标记的单链反义RNA探针188

13.2.2 RNA杂交189

13.2.3 RNA酶消化189

13.2.4　凝胶电泳和放射自显影189

13.3　材料与试剂190

13.3.1 试剂190

13.3.2　仪器设备190

13.4　相关知识190

13.4.1　背景知识190

13.4.2　关键因素191

13.4.3 时间安排191

13.4.4　预期结果191

参考文献192

第三部分　蛋白质相关的操作196

第14章　蛋白质分离、鉴定相关技术196

14.1 蛋白的双向电泳196

14.1.1 样品的准备196

14.1.2 电泳199

14.1.3 蛋白的检测203

14.1.4 问题解决及关键因素205

14.1.5 时间花费207

14.1.6 背景信息208

14.2 酶联免疫吸附测定法（ELISA）208

14.2.1 实验原理208

14.2.2　材料与试剂210

14.2.3 背景知识211

14.2.4 影响因素211

14.2.5 问题解决212

14.2.6 时间安排213

14.2.7 预期结果213

14.3　Western印迹法214

14.3.1 实验原理214

14.3.2　材料、试剂和仪器215

14.3.3　试剂的配制方法215

14.3.4　方法与步骤217

14.3.5 背景信息221

14.3.6 问题解决221

14.3.7　关键因素222

14.3.8 时间花费224

参考文献224

第15章　染色质免疫沉淀技术（ChIP）229

15.1 概述229

15.2　实验方案231

15.2.1 甲醛交联细胞231

15.2.2 染色质超声断裂231

15.2.3 免疫沉淀蛋白和DNA复合物231

15.2.4 收获免疫复合物（抗体-蛋白质-DNA）232

15.2.5　洗脱免疫复合物232

15.2.6　去除甲醛交联232

15.2.7 DNA纯化232

15.2.8 染色质免疫沉淀DNA的分析和蛋白质在DNA上结合位点的鉴定233

15.3　材料试剂233

15.3.1 试剂233

15.3.2　仪器设备234

15.4　相关知识234

15.4.1 背景知识234

15.4.2　关键因素235

15.4.3 时间安排235

15.4.4　预期结果235

参考文献235

第16章　蛋白复合体的分离与鉴定238

16.1 Yoshihiro Nakatani的研究方法（Sasaki,Mello et al.,2009）239

16.1.1 稳定表达目的蛋白的载体系统239

16.1.2　逆转录病毒载体转染包装细胞240

16.1.3　逆转录病毒的转导241

16.1.4　转导阳性细胞的分选242

16.1.5 带有表位标签外源蛋白表达的检测243

16.1.6　细胞的大规模培养244

16.1.7 细胞不同组分的分离245

16.2　分离蛋白复合体的具体操作247

16.2.1 MAML1内源性蛋白复合体的分离247

16.2.2 免疫亲和纯化MAML1蛋白复合体的实验操作250

16.2.3 其他蛋白复合体的实验操作255

16.2.4　后续实验操作的具体实验方案260

参考文献262

第17章　免疫沉淀266

17.1 实验原理266

17.2　仪器、材料和试剂267

17.2.1 裂解缓冲液267

17.2.2　其他试剂267

17.2.3　仪器和材料268

17.3　方法与步骤268

17.3.1 裂解产物的准备268

17.3.2　裂解液的预处理269

17.3.3　免疫沉淀269

17.4　背景知识270

17.5　关键参数270

17.5.1　抗原的提取270

17.5.2　抗体的产量270

17.5.3 多抗单抗的选择271

17.5.4　抗体滴度271

17.5.5　免疫吸附剂271

17.5.6 非特异性对照的设立271

17.5.7 洗涤271

17.6　问题解决272

17.6.1 非特异性条带272

17.6.2 分离胶高背景272

17.6.3　轻链重链显示272

17.7　预期结果272

17.8 时间花费272

17.9　注意事项273

17.9.1　抗体的性质273

17.9.2　缓冲液的性质273

17.9.3 防止蛋白变化273

17.9.4　抗体／缓冲液的比例273

17.10　抗体与Beads配对表273

参考文献274

第18章　免疫荧光染色技术276

18.1 概述276

18.2　实验原理276

18.3　仪器、材料和试剂276

18.4　方法与步骤277

18.4.1 制片277

18.4.2 固定277

18.4.3 水洗277

18.4.4 染色278

18.5　预期结果278

18.6　背景知识278

18.7　关键参数279

18.8　问题解决279

18.9　时间花费279

18.10　标本保存280

18.11 注意事项280

18.12　非特异性染色的消除方法280

18.12.1 主要原因280

18.12.2 消除方法280

18.13　常用固定方法与试剂283

参考文献283

第四部分　细胞生物学相关的操作286

第19章　外源基因在原核生物中的表达286

19.1　概述286

19.2　实验方案286

19.2.1 外源基因的诱导表达286

19.2.2 大肠杆菌包含体的分离与蛋白质纯化287

19.3　材料试剂288

19.3.1　诱导表达材料288

19.3.2 大肠杆菌包含体的分离与蛋白纯化材料288

19.4　背景知识289

19.5　关键因素及注意事项289

19.5.1　表达前的准备要素289

19.5.2　获得目的基因290

19.5.3　构建重组表达载体290

19.5.4 包含体的纯化290

19.6　时间安排291

参考文献291

第20章　外源基因在真核细胞中的表达293

20.1 真核细胞常用表达载体293

20.1.1 pCMVp-NEO-BAN载体293

20.1.2　pEGFP：增强型绿色荧光蛋白表达载体293

20.1.3 pEGFT-Actin：增强型绿色荧光蛋白／人肌动蛋白表达载体293

20.1.4　pSV2表达载体294

20.1.5 CMV4表达载体294

20.1.6　其他常用克隆Vector294

20.2　外源基因导入哺乳动物细胞中的技术方法294

20.2.1 磷酸钙细胞转染技术295

20.2.2 电穿孔转染法297

20.2.3 脂质体介导DNA转染法300

20.2.4　病毒载体介导的基因转移302

20.2.5 DEAE-葡聚糖法309

参考文献311

第21章　转基因植物314

21.1 植物组织培养所需母液的配制314

21.1.1 实验用具和药品314

21.1.2 配制内容与步骤314

21.1.3 注意事项316

21.2　原生质体分离316

21.2.1 仪器、材料和试剂316

21.2.2　方法与步骤317

21.3　植物转基因技术317

21.3.1 植物转基因技术的基本路线317

21.3.2　转基因的受体系统317

21.3.3 外源基因导入植物的方法318

21.4　转基因植物的筛选与检测327

21.4.1 抗性基因327

21.4.2　显色或发光报告基因327

21.4.3　分子生物学检测方法329

21.5　改进转基因的技术329

21.5.1 转基因植物中外源基因的沉默329

21.5.2　提高外源基因表达水平的策略330

参考文献332

第22章　转基因动物技术333

22.1　显微注射法333

22.1.1 实验原理333

22.1.2　基本步骤333

22.1.3 　实验详细步骤333

22.1.4 时间花费342

22.1.5 关键参数及问题解决342

22.2　胚胎干细胞方法343

22.2.1 实验原理343

22.2.2　ES细胞的建立与维持343

22.2.3　ES细胞的基因组操作344

22.2.4　转基因ES细胞的筛选——正负选择法344

22.2.5 转基因ES细胞的检测345

22.2.6　转基因小鼠的繁育345

22.2.7　获得纯合的转基因鼠345

22.2.8　本法优劣345

22.3　反转录病毒法346

22.3.1 反转录病毒感染法的原理346

22.3.2　反转录病毒感染法的载体构建346

22.3.3 通过物理方法将重组DNA分子转入包装细胞346

22.3.4　本法优劣347

22.4　其他方法347

22.4.1　精子载体法347

22.4.2　体细胞核移植法347

22.4.3　受体介导法348

参考文献348

第23章　细胞凋亡的分子生物学检测方法350

23.1 概述350

23.2　实验方案350

23.2.1 形态学观察350

23.2.2　磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）351

23.2.3 Caspase-3活性的检测352

23.2.4 DNA琼脂糖凝胶电泳检测法352

23.2.5 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记检测法（TUNEL检测法）353

23.3　材料试剂354

23.3.1 形态学观察354

23.3.2　磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）355

23.3.3 Caspase-3活性的检测355

23.3.4 DNA琼脂糖凝胶电泳检测法355

23.3.5 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记检测法（TUNEL检测法）355

23.4　背景知识356

23.4.1 电镜检测法356

23.4.2　磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V检测法）356

23.4.3 Caspase-3活性的检测357

23.4.4 DNA琼脂糖凝胶电泳检测法357

23.4.5 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记检测法（TUNEL检测法）357

23.5　关键因素及注意事项357

23.5.1 Annexin V检测法注意事项357

23.5.2　Caspase-3活性检测358

23.5.3 TUNEL检测法常见问题及解决方法358

23.6　时间安排358

23.7　预期结果359

参考文献359

附录　分子生物学实验室安全及注意事项361