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第一章 绪论1

第一节 食品生物技术概述1

一、食品生物技术的定义1

二、食品生物技术在食品工业中的重要地位与作用2

三、食品生物技术的研究进展4

第二节 食品生物技术的应用领域与发展趋势8

一、拓展可食用资源8

二、改进食品加工工艺9

三、改善食品性能提高食品质量10

四、开发功能食品及新型食品11

五、提高农副产品的加工深度11

六、增加食品包装功能11

七、保证食品营养与安全14

八、在食品贮藏保鲜中的应用16

九、食品生物技术的发展趋势18

参考文献19

第二章 食品微生物制造21

第一节 概述21

一、微生物制造及其市场分析21

二、食品微生物制造及在食品工业中的重要地位22

第二节 食品微生物制造的类型22

一、微生物制造传统生物食品22

二、微生物制造食品用酶制剂23

三、微生物制造有机酸24

四、微生物制造增稠剂25

五、微生物制造生物防腐剂27

六、微生物制造维生素29

七、微生物制造油脂31

八、微生物制造食品添加剂31

九、微生物制造色素31

十、微生物制造香精香料32

第三节 食品微生物制造中的关键科学问题32

一、后基因组时代的食品微生物制造的特点32

二、食品制造微生物生理功能的影响因素34

第四节 食品微生物的功能调控与优化研究现状36

一、微生物必需基因的鉴定36

二、基于系统生物学和代谢工程的微生物细胞功能改造策略36

三、辅因子工程技术提高微生物代谢效率39

四、提高食品制造微生物对非生宜环境适应能力的代谢工程策略41

参考文献46

第三章 重要食品制造微生物代谢工程与生理功能49

第一节 重要食品微生物基因组测序与特性分析49

一、食品微生物基因组学49

二、典型食品微生物基因组学研究进展51

三、食品微生物基因组学的应用59

第二节 乳酸菌代谢工程与生理功能改造策略61

一、基于基因工程和代谢工程的乳酸菌分子改造62

二、基于病理生物技术的乳酸菌改造策略64

三、基于生理功能的乳酸菌改造策略65

第三节 霉菌代谢工程与生理功能改造策略68

一、霉菌及其应用68

二、霉菌的基因操作平台68

三、霉菌生理功能改造策略72

第四节 酵母代谢工程与生理功能改造策略74

一、酵母基因工程原理74

二、改良酵母细胞生理特性77

第五节 杆菌代谢工程与生理功能改造策略79

一、杆菌及其在食品工业中的应用79

二、杆菌的代谢工程和生理改造策略80

参考文献85

第四章 利用代谢工程手段改善乳酸乳球菌胁迫抗性的研究89

第一节 代谢工程策略改善乳酸菌胁迫研究概述89

一、乳酸乳球菌在代谢工程中的重要作用89

二、乳酸乳球菌面临的胁迫90

三、提高乳酸乳球菌抵御胁迫的策略91

第二节 在乳酸乳球菌NZ9000中生产外源谷氨酰胺转氨酶显著改善宿主菌好氧生长性能95

一、mtg基因在乳酸乳球菌NZ9000中的活性表达96

二、巯基乙醇对乳酸乳球菌NZ9000（pFL010）和乳酸乳球菌NZ9000（pNZ8148）好氧生长的影响97

三、mtg基因在乳酸乳球菌胞内活性表达促进了细胞好氧生长97

四、pH对乳酸脱氢酶和NADH氧化酶活性的影响101

五、乳酸乳球菌在不同培养条件下生物量的比较101

六、关于mtg基因在乳酸乳球菌中的表达的三个问题102

第三节 在乳酸乳球菌NZ9000中生产外源谷氨酰胺转氨酶对宿主菌胁迫抗性的影响104

一、乳酸乳球菌NZ9000（pFL010）和乳酸乳球菌NZ9000（pNZ8148）氧胁迫抗性的比较105

二、MTG的分离纯化107

三、MTG纯酶清除氧自由基活性的测定107

第四节 谷胱甘肽保护乳酸乳球菌NZ9000抵抗氧胁迫109

一、半胱氨酸对乳酸乳球菌好氧生长的影响110

二、GSH对乳酸乳球菌NZ9000抵抗H2O2氧胁迫抗性的影响110

三、GSH对乳酸乳球菌NZ9000抵抗甲萘醌引发的氧胁迫抗性的影响112

四、GSH对乳酸乳球菌NZ9000的SodA缺失的互补作用114

五、GSH保护乳酸乳球菌的生理机制116

第五节 谷胱甘肽保护乳酸乳球菌SK11抵抗氧胁迫和酸胁迫118

一、GSH在乳酸乳球菌SK11中的生产118

二、GSH对乳酸乳球菌SK11生长的影响120

三、GSH对乳酸乳球菌SK11氧胁迫抗性的影响121

四、乳酸乳球菌SK11（pNZ9530/pNZ3203）和乳酸乳球菌SK11（pNZ9530/pNZ8148）发酵液中NH4＋浓度的比较122

第六节 一株具有谷胱甘肽合成能力的乳酸乳球菌的分离与初步研究122

一、乳酸乳球菌选择性培养基的确定123

二、产GSH的乳酸乳球菌的初筛123

三、引物的设计及产GSH的乳酸乳球菌的复筛123

四、菌株3C的系统发育树分析与形态鉴定124

五、乳酸乳球菌CCSYU10100的好氧生长125

六、乳酸乳球菌CCSYU10100产GSH能力的鉴定125

七、乳酸乳球菌CCSYU10100部分gshB基因的分析125

参考文献127

第五章 谷胱甘肽对乳酸菌胁迫抗性的调控机制研究130

第一节 谷胱甘肽对乳酸菌胁迫抗性的调控机制研究130

一、乳酸菌及其在食品工业中的应用130

二、乳酸菌在食品微生物制造过程中遭遇的冷冻胁迫132

三、谷胱甘肽改善乳酸菌的生理性能133

第二节 外源添加谷胱甘肽显著提高旧金山乳杆菌DSM20451T冷冻胁迫抗性134

一、在化学合成培养基（CDM）中旧金山乳杆菌对GSH的吸收135

二、添加时间和添加浓度对MRS培养基中旧金山乳杆菌胞内GSH浓度积累的影响135

三、经历不同前培养时期的菌体冷冻抗性比较136

四、GSH对冷冻胁迫后细胞生长速率的影响137

五、细胞内外GSH在抗冷冻胁迫中的作用比较138

六、GSH与谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸混合物对细胞冷冻抗性的作用比较139

第三节 谷胱甘肽对冷冻胁迫前后旧金山乳杆菌DSM20451T代谢活性的调控140

一、冷冻胁迫前GSH添加对旧金山乳杆菌DSM20451T代谢的影响141

二、冷冻胁迫条件下GSH对旧金山乳杆菌DSM20451T代谢的影响142

三、重培养过程中代谢关键酶活性的变化144

四、冷冻胁迫和重培养过程中胞内GSH浓度的变化144

五、冷冻胁迫下胞内pH的变化145

第四节 谷胱甘肽对冷冻胁迫中细胞膜损伤的抵御机制147

一、GSH对冷冻胁迫过程中旧金山乳杆菌DSM20451T细胞膜结构的影响147

二、GSH对冷冻胁迫过程中旧金山乳杆菌DSM20451T细胞膜脂肪酸成分的影响147

三、冷冻胁迫中GSH对细胞膜中亚油酸含量的影响150

四、冷冻胁迫条件下旧金山乳杆菌DSM20451T胞内氧化还原状态的变化151

五、冷冻胁迫中GSH对Na+,K+-ATPase的保护作用153

第五节 蛋白质组水平上谷胱甘肽对旧金山乳杆菌DSM20451T冷冻胁迫抗性的影响155

一、冷冻胁迫前旧金山乳杆菌DSM20451T（GSH+）与DSM20451T（GSH-）的蛋白质组学分析156

二、冷冻胁迫后旧金山乳杆菌DSM20451T（GSH+）与DSM20451T（GSH-）的蛋白质组学分析157

三、二维电泳图谱的蛋白质差异点分析158

第六节 谷胱甘肽对乳酸菌酸胁迫抗性的影响161

一、GSH对乳酸菌抗酸胁迫能力的影响162

二、酸胁迫过程中胞内pH（pHi）的变化164

三、GSH在酸胁迫过程中的浓度变化166

四、GSH对酸胁迫过程中3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）的调控166

参考文献168

第六章 吸水链霉菌谷氨酰胺转氨酶的活化机制和生理功能170

第一节 吸水链霉菌发酵生产谷氨酰胺转氨酶研究进展170

一、谷氨酰胺转氨酶简介170

二、链霉菌简介173

三、链霉菌中谷氨酰胺转氨酶的活化177

第二节 Streptomyces hygroscopicus液体培养中谷氨酰胺转氨酶以酶原形式分泌179

一、TGase和Pro-TGase的分离、纯化179

二、Pro-TGase的鉴定181

三、吸水链霉菌液体培养中TGase以酶原形式分泌183

第三节 Streptomyces hygroscopicus液体培养中谷氨酰胺转氨酶活化过程的定位184

一、无细胞上清液中TGase活化的沉默184

二、细胞壁和细胞膜碎片对无细胞上清液中TGase活化的影响185

三、无细胞上清液中TGase活化过程的唤醒185

四、CTAB唤醒无细胞上清液中TGase活化过程的机制186

第四节 Streptomyces hygroscopicus液体培养中谷氨酰胺转氨酶活化蛋白酶的分离纯化和种类鉴定189

一、TGase活化蛋白酶的纯化189

二、部分纯化的TAP酶样品中蛋白酶种类的确定190

三、无细胞上清液中TGase活化蛋白酶种类的确定191

四、TGase活化过程是多种蛋白酶参与的过程192

第五节 Streptomyces hygroscopicus液体培养中谷氨酰胺转氨酶活化蛋白酶抑制因子的纯化、鉴定及其表面活性的发现195

一、TGase活化蛋白酶抑制因子的纯化195

二、TAPI的鉴定195

三、TAPI是一种表面活性蛋白198

四、TAPI调控的TGase活化过程的模型198

五、TAPI表面活性的生理意义199

第六节 Streptomyces hygroscopicus固体培养中谷氨酰胺转氨酶的活化过程及谷氨酰胺转氨酶抑制剂对菌体分化的抑制200

一、吸水链霉菌固体培养中TGase的活化200

二、CTAB促进固体培养浸出液中TGase的活化201

三、胱胺对分化的抑制202

四、TGase的生理功能202

参考文献204

第七章 软化类芽孢杆菌α-环糊精葡萄糖基转移酶在大肠杆菌中的表达及其产物特异性分析207

第一节 α-环糊精葡萄糖基转移酶概述207

一、α-环糊精葡萄糖基转移酶的结构、功能及反应机理207

二、CGT酶发酵生产的研究进展212

第二节 软化类芽孢杆菌α-CGT酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达218

一、表达载体pET-20b(+)/cgt和pET-22b(+)/cgt的构建218

二、大肠杆菌表达系统的构建220

三、重组酶在E.coli BL21(DE3)［pET-20b(+)/cgt］中的胞外生产220

第三节 采用两阶段温度控制策略提高重组α-CGT酶的胞外产量223

一、在不同诱导温度下重组α-CGT酶胞外分泌过程223

二、两阶段诱导温度控制策略的确定224

三、升温时间对重组α-CGT酶胞外生产的影响225

四、两阶段温度控制对重组α-CGT酶在胞内外分布的影响225

五、相关机理探讨226

第四节 甘氨酸与钙离子协同提高重组α-CGT酶的胞外产量231

一、甘氨酸或钙离子对α-CGT重组酶胞外分泌的影响231

二、甘氨酸或钙离子对大肠杆菌细胞膜透性的影响232

三、甘氨酸或钙离子对大肠杆菌细胞生长的影响233

四、钙离子能补偿甘氨酸对大肠杆菌细胞生长的抑制作用235

五、甘氨酸和钙离子同时添加对大肠杆菌细胞膜透性的影响237

六、甘氨酸和钙离子协同提高重组α-CGT酶的胞外产量237

第五节 重组α-CGT酶的分离纯化及其生化性质分析238

一、天然和重组α-CGT酶的纯化238

二、物理性质239

三、最适温度和热稳定性239

四、最适pH和pH稳定性240

五、二价金属离子对环化活力的影响241

六、产物特异性242

七、动力学分析242

第六节 亚位点-3处定点突变提高CGT酶的α-环糊精特异性243

一、突变CGT酶的表达与纯化243

二、定点突变影响CGT酶的不同环化活力244

三、定点突变影响不同环糊精的生产245

四、定点突变提高CGT酶的α-环糊精特异性246

第七节 47位赖氨酸突变提高CGT酶的α-环糊精特异性248

一、多重序列比对248

二、突变CGT酶的表达与纯化248

三、Lys47对α-环化反应非常重要249

四、Lys47突变增加β-环化活力250

五、Lys47突变提高CGT酶的β-环糊精特异性251

参考文献253

第八章 光滑球拟酵母中ATP的生理功能与作用机制255

第一节 ATP生理功能概述255

一、胞内微环境在微生物细胞生长和产物积累过程中的重要作用256

二、胞内ATP供给水平的调控策略258

三、基于ATP水平调控的发酵过程优化260

第二节 光滑球拟酵母基因操作系统的构建262

一、G418抗性试验263

二、敲除框的构建263

三、缺陷型突变株的富集与筛选264

四、营养缺陷型突变株的验证265

五、增强型绿色荧光蛋白的可诱导表达266

六、质粒稳定性266

第三节 线粒体基因敲除过程中的单细胞线粒体基因组多样性267

一、线粒体转化269

二、mtDNA转化子可以在YPG平板上生长269

三、mtDNA转化子选择性丢失mtDNA(△atp6::ARG8m)270

四、mtDNA异质性的存在270

五、寡霉素和厌氧培养可以降低mtDNA（△atp6::ARG8m）的丢失率271

六、厌氧培养对线粒体和mtDNA拷贝数的影响273

七、厌氧培养降低ATP6/ARG8m比例274

八、mtDNA（ATP6）的消除274

九、研究意义274

第四节 膜间腔中H＋的过量积累导致ATP6缺失菌株mtDNA不稳定278

一、NADH氧化途径对ATP6敲除菌株中mtDNA稳定性的影响279

二、T.glabrata及其突变株的胞内ATP浓度280

三、T.glabrata及其突变株的胞内ROS浓度280

四、MIMS中H＋的过量积累281

五、ATP6缺失菌株中△ψm的不均一性281

六、乌头酸酶的转录与定位分析283

七、研究意义284

第五节 ATP合成酶亚基缺失对光滑球拟酵母中心代谢途径的影响287

一、ATP合成酶基因敲除及noxE的表达对发酵特性的影响288

二、代谢网络分析289

三、ATP合成酶基因敲除及noxE的表达对胞内ATP水平的影响289

四、ATP合成酶基因敲除及noxE的表达对低pH和渗透压耐受性的影响289

五、中心代谢关键酶基因的转录分析291

六、中心代谢途径关键酶活性分析291

七、研究意义293

第六节 依赖ATP的pH平衡过程在细胞抵御酸胁迫中的作用296

一、柠檬酸促进低pH值条件下T.glabrata的生长296

二、胞外pH值对胞内ATP浓度的影响297

三、柠檬酸添加促进能量代谢298

四、提高ATP浓度促进pH梯度的维持过程299

五、pH对糖酵解关键酶活性的影响300

六、pH梯度与胞内ATP浓度的关系301

七、研究意义301

参考文献303