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第一章 培养细胞的生存条件和环境1

第一节 体外细胞生存的营养条件1

一、水1

二、无机盐类2

三、糖类3

四、维生素4

五、氨基酸6

六、温度7

七、氧和酸碱度8

八、细胞之间的相互联系10

第二节 培养用液12

一、水与缓冲液12

二、生理盐水与平衡盐溶液15

第三节 培养基16

一、发展史16

二、物理化学特征18

三、完全培养基20

四、血清培养基和血清的选择21

五、其他添加物27

第四节 无血清培养基31

一、使用含血清培养基的缺点31

二、无血清培养基的优缺点32

三、无血清培养基的血清替代35

四、无血清培养基的选择与制备38

第五节 体外细胞的生长环境41

一、体外培养实验室41

二、体外培养的设备与器具45

第二章 培养细胞的生物学特性51

第一节 细胞黏附51

一、吸附和接触51

二、贴壁51

三、铺展52

第二节 细胞增殖52

一、细胞周期52

二、细胞增殖和培养细胞的生命分期55

第三节 细胞分化58

一、细胞分化潜能的变化58

二、体外培养细胞分化状态的维持58

第四节 细胞去分化59

第五节 能量代谢59

第六节 细胞系的演化60

第七节 连续细胞系的形成61

第八节 体外培养细胞的生长类型62

一、黏附型细胞62

二、悬浮型细胞64

第三章 细胞培养实验室的布局66

第一节 实验室规划及使用布局66

一、总体原则66

二、细胞培养实验室的组成与布局66

第二节 无菌操作设施和工作间68

一、常用的无菌操作设施68

二、细胞培养工作间68

第三节 实验室设备69

第四节 器械及消耗性物品72

一、手术器械72

二、消耗性物品73

第四章 无菌技术77

第一节 概述77

一、目标77

二、灭菌操作77

三、层流标准78

四、方法79

五、仪器和设备82

第二节 准备与灭菌82

一、设备、试剂和培养基83

二、培养基的质控、检测和储存90

第三节 清洗和消毒92

一、培养用具的清洗92

二、培养用品的消毒和灭菌93

第五章 细胞分离技术102

第一节 利用细胞体积和密度差异进行细胞分离纯化102

一、一步密度梯度离心法102

二、等密度梯度离心法105

第二节 根据细胞表面电荷的细胞分离纯化110

一、自由流动电泳分离技术110

二、密度梯度电泳分离技术111

第三节 利用细胞表面标志进行细胞分离纯化111

一、免疫溶解法111

二、盘化法113

三、凝集素凝集法115

四、玫瑰花环分离法117

五、流式细胞分选术120

六、免疫磁珠分离技术124

第四节 利用其他细胞学特性分离纯化细胞的方法125

一、反复植块法125

二、有丝分裂抑制剂处理125

第六章 细胞培养观察和检测技术128

第一节 显微镜技术128

一、普通显微镜的构造及使用方法128

二、相差显微镜的构造及使用方法130

三、荧光显微镜的构造及使用方法132

四、激光共聚焦显微镜的原理、构造及应用134

五、透射电子显微镜与超薄切片技术137

六、扫描电子显微镜与样品制备139

七、显微摄影技术140

八、活细胞的动态观察与缩时电影141

第二节 细胞及细胞成分染色及显示142

一、苏木素伊红（Hematoxylin and Eosin，HE）染色法142

二、吉姆萨（Giemsa）染色法143

三、载玻片处理方法143

四、活细胞体外活体染色观察与活体染料143

五、细胞中糖类和脂类的显示144

六、细胞中过氧化物酶的显示146

七、细胞中一氧化氮合酶的显示146

八、细胞中琥珀酸脱氢酶的显示147

九、细胞中酸性磷酸酶的显示147

十、细胞中碱性蛋白的显示148

十一、细胞中线粒体的活体染色149

十二、微丝的染色及形态观察149

十三、胞质微管的间接免疫荧光显示技术150

十四、细胞中DNA与RNA的吖啶橙荧光染色法151

十五、细胞中DNA的富尔根（Feulgen）染色法151

第七章 细胞培养基本技术154

第一节 细胞传代和换液154

一、原代培养154

二、继代培养157

三、细胞换液158

第二节 细胞培养的基本方法和技术159

一、悬滴培养法159

二、盖玻片培养法159

三、培养瓶培养法160

四、培养板培养法160

五、旋转管培养法161

六、灌注小室培养法162

七、二倍体细胞培养法165

八、克隆培养法165

九、中空纤维细胞培养技术166

十、微载体细胞培养法168

十一、微囊培养技术169

第三节 细胞活性及计数170

一、活细胞的染料排除检测法170

二、细胞增殖活性测定的3H-TdR掺入法171

三、细胞活力测定的MTT比色法171

四、细胞生长曲线172

五、细胞计数法173

第四节 细胞的冻存和复苏176

一、冷冻保存的必要性176

二、培养物的冷冻保存与复苏原理176

三、冷冻及复苏方法178

第八章 细胞培养特殊技术182

第一节 细胞克隆182

一、克隆培养技术182

二、影响克隆形成率的因素186

三、克隆的分离188

第二节 定量细胞计数189

一、细胞重量189

二、DNA含量190

三、蛋白质含量190

四、细胞计数术191

五、重复取样问题191

第三节 细胞周期与细胞同步化191

一、细胞周期192

二、细胞周期分析194

三、细胞同步化198

第四节 细胞融合201

一、细胞融合的基本技术201

二、融合细胞的筛选206

三、融合细胞的克隆化207

四、细胞融合的杂交瘤208

第五节 细胞凋亡的测定209

一、凋亡细胞普通光镜下形态观察209

二、凋亡细胞荧光显微镜下形态观察209

三、凋亡细胞电镜下形态观察209

四、凋亡细胞琼脂糖凝胶电泳检测——DNA梯状条带（DNA Ladder）210

五、凋亡细胞的原位末端标记法检测210

六、凋亡细胞的流式细胞法检测210

七、磷脂酰丝氨酸外化的流式细胞术分析211

第六节 细胞遗传学性状检测211

一、性染色质检测211

二、培养细胞染色体显示法212

三、染色体结构显示和检测213

四、染色体基因定位215

五、染色体显微切割法217

第七节 杂交瘤技术与单克隆抗体制备技术218

一、杂交瘤技术218

二、单克隆抗体222

第八节 基因转染技术与体外细胞转化226

一、基因转染技术227

二、体外细胞转化232

第九章 常用医用细胞培养236

第一节 呼吸系统上皮细胞培养236

一、人支气管上皮细胞培养236

二、兔呼吸道纤毛上皮细胞培养238

三、小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞培养240

四、人鼻咽上皮细胞培养242

第二节 消化系统上皮细胞培养244

一、人食管黏膜上皮细胞培养244

二、人胃黏膜上皮细胞培养246

三、小肠黏膜上皮细胞（IEC）培养248

四、大鼠胰腺导管上皮细胞培养251

第三节 腺上皮细胞培养254

一、人涎腺上皮细胞培养254

二、牛乳腺上皮细胞培养258

第四节 表皮细胞培养261

一、人皮肤角质形成细胞的无血清培养261

二、人表皮黑色素细胞培养262

第五节 血管内皮细胞培养264

一、人脐静脉血管内皮细胞培养264

二、人肾小球微血管内皮细胞体外培养266

三、猪血管内皮细胞体外培养268

四、人眼脉络膜血管内皮细胞体外培养270

五、大鼠脑微血管内皮细胞培养272

第六节 胸腺上皮细胞培养279

第七节 结缔组织细胞培养283

一、结缔组织细胞生物学特点283

二、结缔组织细胞分离方法287

三、成纤维细胞培养288

四、巨噬细胞培养302

五、脂肪细胞培养307

六、肥大细胞培养311

七、间充质干细胞培养316

第八节 肌肉组织细胞培养321

一、心肌细胞培养321

二、平滑肌细胞培养340

三、骨骼肌细胞培养348

第九节 眼组织细胞培养359

一、角膜上皮细胞和内皮细胞培养359

二、小梁细胞培养363

三、视网膜色素上皮细胞培养366

四、晶状体上皮细胞培养370

五、视网膜米勒细胞培养372

第十节 骨与软骨组织细胞培养378

一、成骨细胞培养378

二、破骨细胞培养384

三、滑膜细胞培养386

四、软骨细胞培养388

第十一节 泌尿、生殖系统细胞培养391

一、肾小球系膜细胞培养391

二、肾小管上皮细胞培养394

三、睾丸支持细胞培养396

四、睾丸间质细胞培养397

五、生精细胞培养399

第十二节 内分泌细胞培养400

一、胰岛细胞培养400

二、人垂体腺细胞培养401

三、甲状腺细胞培养402

第十三节 羊水细胞培养403

一、羊水细胞培养的基本方法403

二、羊水细胞的富集培养法404

第十四节 神经组织细胞培养406

一、神经元培养406

二、星形胶质细胞培养412

三、少突胶质细胞培养413

四、施旺细胞培养415

五、小胶质细胞培养416

六、其他神经胶质细胞的培养——嗅鞘细胞体外培养419

七、体外培养神经组织分离细胞的形态学特征比较422

第十五节 造血祖细胞培养426

一、造血祖细胞培养的实验材料426

二、造血祖细胞的富集与分离431

三、造血祖细胞的培养技术435

第十六节 淋巴细胞培养438

一、各类淋巴细胞的主要特征439

二、淋巴细胞的体外培养方法和应用446

三、淋巴细胞的体外长期培养454

第十七节 胚胎干细胞培养457

一、体外培养胚胎干细胞的技术原理458

二、体外培养胚胎干细胞的基本过程458

三、胚胎干细胞的鉴定466

第十章 常用肿瘤细胞培养476

第一节 肿瘤细胞在体内外生长特性概论476

一、肿瘤细胞体内生长的特征476

二、肿瘤细胞体外生长的生物学特性478

三、肿瘤细胞在体内和体外的生长特性差别479

第二节 肿瘤组织细胞培养方法480

一、肿瘤组织细胞的原代培养480

二、肿瘤细胞的传代483

三、肿瘤细胞的克隆培养法485

第三节 部分肿瘤细胞系的建立和体外培养486

一、人鼻咽癌细胞系（CNE2）的建立和体外培养486

二、人骨肉瘤细胞系（HOS-8603）的建立和体外培养487

三、人胃癌细胞系的建立和体外培养488

四、人卵巢癌细胞系的建立和体外培养490

五、人白血病／淋巴瘤细胞系的建立和体外培养491

六、人脑肿瘤细胞系的建立和体外培养493

七、人神经母细胞瘤细胞系的建立和体外培养495

八、人肝癌细胞系的建立和体外培养497

九、人乳腺癌细胞系的建立和体外培养498

十、人肺腺癌细胞系的建立和体外培养500

第四节 肿瘤细胞培养的应用502

一、肿瘤细胞对组织浸润的体外研究502

二、人恶性肿瘤细胞的动物移植瘤研究504

第十一章 细胞规模培养508

第一节 单层规模培养508

一、转管及转瓶培养508

二、旋转圆柱管培养509

第二节 悬浮规模培养509

一、细胞对悬浮培养的适应509

二、规模培养的方法510

第三节 细胞规模培养中的问题、对策及展望511

第十二章 细胞培养过程中的污染及处理513

第一节 污染途径513

第二节 污染对细胞的影响514

第三节 微生物污染的判断517

一、微生物污染的一般特征及判断517

二、细菌的污染及其判断518

三、真菌的污染及其判断518

四、支原体的污染及其判断519

五、病毒的污染及其判断523

第四节 交叉污染524

第五节 污染的预防525

一、从空气方面来预防525

二、从生物材料方面来预防525

三、从试剂方面来预防525

四、从仪器设备和装置方面来预防525

五、从操作技术方面来预防526

第六节 污染的处理526

一、抗生素的应用527

二、加温除菌法528

三、动物体内接种528

四、巨噬细胞吞噬法529

五、其他方法529

第十三章 细胞培养的常见问题及对策531

第一节 细胞生长缓慢531

一、培养液531

二、消化液532

三、传代532

四、污染532

第二节 某些不稳定的试剂配制532

一、谷氨酰胺532

二、胰蛋白酶532

三、血清533

四、培养基中的其他成分533

第三节 培养基各种成分的纯度533

一、纯水器533

二、塑料制品533

三、玻璃器皿534

四、血清534

五、碳酸氢钠534

第四节 化学污染534

一、对于来自玻璃器皿的化学污染的对策534

二、对于来自吸液管的化学污染的对策534

三、对于来自试剂的化学污染的对策535

四、对于来自粉末或气溶胶的化学污染的对策535

第五节 其他535

一、冻存细胞成颗粒性535

二、成活率535

附录537

附录1 中外细胞库及其所提供的细胞目录537

一、中国典型培养物保藏中心细胞库及其可提供的细胞目录537

二、中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库可供的细胞目录542

三、美国典型物保藏中心细胞库及其可提供的细胞目录553

附录2 细胞培养常用培养用液配方564

一、缓冲液的配制564

二、消化液的配制565

三、抗生素液的配制566

四、其他溶液的配制566

五、细胞培养常用培养液的配制567

附录3 两种常用的公式569

一、细胞计数公式569

二、离心力的计算570