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摘要1

目录1

1　前言1

1.1　研究背景1

英文摘要3

1.2　研究意义与目前研究状况3

1.3　研究内容4

1.4　研究总体思路5

1.4.1　基本理论5

缩略词6

1.4.2　细胞培养实验流程6

1.4.3　动物实验流程6

2　低氧调节培养人脐静脉内皮细胞HIF-1与VEGF、Flt-1 DNA结合活性的研究7

2.1　材料与方法8

2.1.1　实验仪器8

2.1.2　主要实验试剂及配制9

2.1.2.1　主要实验试剂9

2.1.2.2　主要实验试剂的配制10

2.1.4.1　核蛋白抽提11

2.1.3.2　低氧处理11

2.1.4　实验方法11

2.1.3.1　人脐静脉内皮细胞培养11

2.1.3　细胞的培养及低氧处理11

2.1.4.2　凝胶迁移率变动实验12

2.1.4.3　转膜13

2.1.4.4　检测13

2.1.4.5　凝胶迁移率变动实验结果的凝胶图像分析14

2.2　研究结果14

2.2.1　不同低氧条件下培养液中氧分压检测结果14

2.2.2　HIF-1蛋白与VEGF增强子序列的EMSA实验观察结果14

2.2.4 HIF-1蛋白与VEGF增强子、Flt-1启动子序列的EMSA凝胶图像分析结果15

2.2.3　HIF-1蛋白与Flt-1启动子序列的EMSA实验观察结果15

2.3　分析与讨论16

2.4　小结19

3　低氧及运动促进HIF-1α表达对大鼠肌组织VEGF、Flt-1 mRNA的影响20

3.1　材料与方法21

3.1.1　实验仪器21

3.1.2　实验试剂及药品22

3.1.3　实验对象及分组23

3.1.4　运动训练安排23

3.1.5　低氧处理24

3.1.6　实验取材24

3.1.7.2　HIF-1α免疫组织化学标本制作25

3.1.7　实验方法25

3.1.7.1　动脉血气分析25

3.1.7.3　VEGF、Flt-1 mRNA原位杂交标本制作26

3.1.7.4　免疫组织化学及原位杂交显微图像分析27

3.1.8　统计分析27

3.2　实验结果28

3.2.1　大鼠动脉血气指标检测28

3.2.1.1　动脉血气指标PaO2、O2sat、O2cont检测结果28

3.2.2　大鼠肌组织HIF-1α免疫组织化学及显微图像分析结果29

3.2.2.1　心肌组织HIF-1α免疫组织化学观察结果29

3.2.1.2　PaO2析因试验结果的方差分析29

3.2.2.2　心肌组织HIF-1α免疫组织化学染色的显微图像分析结果31

3.2.2.3　心肌组织HIF-1α免疫组织化学染色析因试验结果的方差分析31

3.2.2.4　骨骼肌组织HIF-1α免疫组织化学观察结果32

3.2.2.5　骨骼肌组织HIF-1α免疫组织化学染色显微图像分析结果32

3.2.2.6　骨骼肌组织HIF-1α免疫组织化学染色析因试验结果的方差分析33

3.2.3　大鼠肌组织VEGF mRNA原位杂交及显微图像分析34

3.2.3.1　心肌组织VEGF mRNA原位杂交观察结果34

3.2.3.2　心肌组织VEGF mRNA原位杂交显微图像分析结果35

3.2.3.3　心肌组织VEGF原位杂交染色析因试验结果的方差分析36

3.2.3.4　骨骼肌组织VEGF mRNA原位杂交观察结果36

3.2.3.5　骨骼肌组织VEGF mRNA原位杂交显微图像分析结果37

3.2.3.6　骨骼肌组织VEGF mRNA原位杂交染色析因试验结果的方差分析38

3.2.4　大鼠肌组织Flt-1 mRNA原位杂交及显微图像分析39

3.2.4.1　心肌组织Flt-1 mRNA原位杂交观察结果39

3.2.4.2　心肌组织Flt-1 mRNA原位杂交染色显微图像分析结果40

3.2.4.3　心肌组织Flt-1 mRNA原位杂交染色析因试验结果的方差分析40

3.2.4.4　骨骼肌组织Flt-1 mRNA原位杂交观察结果41

3.2.4.5　骨骼肌组织Flt-1 mRNA原位杂交显微图像分析结果42

3.2.4.6　骨骼肌组织Flt-1 mRNA原位杂交染色析因试验结果的方差分析42

3.2.6.1 心肌组织VEGF mRNA、Flt-1 mRNA与HIF-1α相关分析结果43

3.2.6　大鼠肌组织VEGF mRNA、Flt-1 mRNA与HIF-1α相关分析43

3.2.5　大鼠肌组织HIF-1α免疫组织化学染色阳性指数与PaO2相关分析43

3.2.6.2　骨骼肌组织VEGF mRNA、Flt-1 mRNA与HIF-1α相关分析44

3.3　分析与讨论45

3.3.1　低氧及运动对大鼠动脉血氧合状态的不同作用45

3.3.2　低氧及运动大鼠动脉血氧合状态的改变对肌组织HIF-1α蛋白表达的影响46

3.3.3　低氧及运动对大鼠肌组织VEGF、Flt-1 mRNA的影响48

3.3.4　HIF-1α对肌组织VEGF、Flt-1 mRNA的促进作用50

3.4　小结51

4　VEGF、Flt-1促进低氧及运动大鼠肌组织血管生成的作用52

4.1.3　实验动物饲养及分组53

4.1.2　实验试剂及药品53

4.1　材料与方法53

4.1.1　实验仪器53

4.1.4　运动训练安排54

4.1.5　低氧处理54

4.1.6　取材及制备55

4.1.7　实验方法55

4.1.7.1　血清VEGF含量的酶联免疫吸附检测55

4.1.7.2　VEGF、Flt-1、CD34免疫组织化学标本制作56

4.1.7.3　VEGF、Flt-1、CD34免疫组织化学显微图像分析56

4.1.7.4　微血管密度参数的测算方法57

4.2.1　大鼠血清VEGF含量的酶联免疫吸附检测58

4.2.1.1　血清VEGF含量的酶联免疫吸附检测结果58

4.1.8　统计分析58

4.2　实验结果58

4.2.1.2　血清VEGF含量析因试验结果的方差分析59

4.2.2　大鼠肌组织VEGF免疫组织化学染色及图像分析59

4.2.2.1　心肌组织VEGF免疫组织化学染色观察结果59

4.2.2.2　心肌组织VEGF免疫组织化学染色的图像分析结果61

4.2.2.3　心肌组织VEGF免疫组织化学染色析因试验结果的方差分析61

4.2.2.4　骨骼肌组织VEGF免疫组织化学染色观察结果62

4.2.2.5　骨骼肌组织VEGF免疫组织化学染色的图像分析结果62

4.2.3.1　心肌组织Flt-1免疫组织化学染色观察结果64

4.2.2.6　骨骼肌组织VEGF免疫组织化学染色析因试验结果的方差分析64

4.2.3　大鼠肌组织Flt-1免疫组织化学染色及图像分析64

4.2.3.2　心肌组织Flt-1免疫组织化学染色的图像分析结果65

4.2.3.3　心肌组织Flt-1免疫组织化学染色析因试验结果的方差分析66

4.2.3.4　骨骼肌组织Flt-1免疫组织化学染色观察结果66

4.2.3.5　骨骼肌组织Flt-1免疫组织化学染色的图像分析结果67

4.2.3.6　骨骼肌组织Flt-1免疫组织化学染色析因试验68

结果的方差分析68

4.2.4.2　心肌组织微血管体视学分析结果69

4.2.4.3　心肌组织微血管密度参数析因试验结果的方差分析69

4.2.4.1　心肌组织CD34免疫组织化学染色观察结果69

4.2.4　大鼠肌组织CD34免疫组织化学染色及微血管体视学分析69

4.2.4.4　骨骼肌组织CD34免疫组织化学染色观察结果71

4.2.4.5　骨骼肌组织微血管体视学分析结果72

4.2.4.6　骨骼肌组织微血管密度参数析因试验结果的方差分析72

4.2.5　大鼠肌组织微血管密度与血清VEGF含量的相关分析73

4.2.5.1　心肌组织微血管密度与血清VEGD含量的相关分析结果73

4.2.5.2　骨骼肌组织微血管密度与血清VEGF含量的相关分析结果74

4.2.6　大鼠肌组织微血管密度与VEGF阳性指数的相关分析74

4.2.6.1　心肌组织微血管密度与VEGF阳性指数的相关分析结果74

4.2.6.2　骨骼肌组织微血管密度与VEGF阳性指数的相关分析结果75

4.2.7.2　骨骼肌组织微血管密度与Flt-1阳性指数的相关分析结果76

4.2.7　大鼠肌组织微血管密度与Flt-1阳性指数的相关分析76

4.2.7.1 心肌组织微血管密度与Flt-1阳性指数的相关分析结果76

4.3　分析与讨论77

4.3.1　低氧及运动对大鼠肌组织微血管数量的影响77

4.3.2　低氧及运动影响大鼠肌组织VEGF、Flt-1蛋白含量对肌组织微血管生成的促进作用80

4.3.3　低氧及运动影响大鼠血浆VEGF含量对肌组织微血管生成的促进作用82

4.4　小结83

5　低氧及运动大鼠肌组织血管生成方式的超微结构研究84

5.1.1　实验仪器85

5.1.2　实验试剂及药品85

5.1　材料与方法85

5.1.3　实验对象及分组86

5.1.4　运动训练安排86

5.1.5　低氧处理87

5.1.6　实验取材87

5.1.7　电镜标本制作87

5.2　实验结果88

5.2.1 大鼠心肌组织毛细血管、肌纤维超微结构透射电镜观察88

5.2.1.1　心肌组织毛细血管透射电镜观察结果88

5.2.2　大鼠骨骼肌组织毛细血管、肌纤维超微结构透射电镜观察90

5.2.2.1　骨骼肌组织毛细血管透射电镜观察结果90

5.2.1.2　心肌组织肌纤维透射电镜观察结果90

5.2.2.2　骨骼肌组织肌纤维透射电镜观察结果91

5.3　分析与讨论94

5.3.1　低氧及运动对大鼠肌组织毛细血管超微结构的影响94

5.3.2　低氧及运动对大鼠肌纤维超微结构的影响96

5.4　小结97

6　结论99

致谢101

参考文献103

附录A　运动肌组织血管生成的低氧适应机制研究进展113

A.1　低氧介导HIF-1α对血管生成缺氧诱导基因转录的调控114

A.1.1　VEGF、Flt-1基因的HIF-1 DNA结合位点的确定115

A.1.2　低氧对HIF-1α与VEGF基因DNA结合活性的影响116

A.1.3 低氧介导HIF-1α对VEGF、Flt-1的转录活性117

A.2　低氧对运动肌组织血管生成的作用118

A.2.1　低氧对运动骨骼肌血管生成的作用118

A.2.2　低氧或运动对心肌血管生成的作用121

A.3 低氧对运动肌组织HIF-1α、VEGF、Flt-1基因表达的影响122

A.3.1　低氧运动对肌组织HIF-1α的影响122

A.3.2　低氧运动对肌组织血管生成低氧诱导基因的影响122

A.3.3　低氧运动下HIF-1α调节肌组织血管生成低氧反应基因的研究124

附录B　文献综述参考文献126