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第一章 引论1

第一节 组织培养的诞生与发展简史1

第二节 组织培养常用术语3

第三节 组织培养常用缩写词（Abbreviations）6

第二章 组织培养基9

第一节 培养基的基本要求9

一、营养成分9

二、促生长因子及激素9

三、渗透压10

四、pH10

五、无毒、无污染10

第二节 天然培养基10

一、血清11

（一）血清的种类11

（二）血清的主要成分及主要作用11

（三）细胞培养中使用血清的缺点12

（四）血清的质量标准12

（五）血清的使用与储存13

二、鼠尾胶原14

（一）制备方法14

（二）使用方法14

三、组织浸出液14

第三节 合成培养基15

一、基本培养基15

（一）基本组分15

（二）种类19

（三）如何选择培养基20

（四）培养基的配制20

二、无血清培养基20

（一）无血清培养基的设计思路21

（二）无血清培养基的基本配方21

（三）使用方法22

三、无蛋白培养基（protein free medium，PFM）和限定化学成分培养基22

（chemical defined medium，CDM）22

第四节 其他培养用液23

一、平衡盐溶液（balanced salt solution，BSS）23

二、消化液23

三、pH调整液24

四、抗生素液24

五、谷氨酰胺补充液24

第三章 细胞培养的设备条件与培养物的检查26

第一节 细胞培养中常用的仪器设备26

一、无菌室26

二、超净工作台26

三、双重纯水蒸馏器26

四、抽气泵27

五、压力蒸气消毒器27

六、电热恒温干燥箱27

七、电热恒温培养箱27

八、CO2培养箱27

九、恒温水浴锅27

十、液氮生物容器28

十一、倒置显微镜28

十二、离心机28

十三、无菌过滤器28

十四、洗刷装置28

十五、细胞计数板和电子细胞计数仪28

第二节 细胞培养的无菌环境29

一、无菌室29

二、超净工作台30

第三节 常用培养器皿31

一、玻璃器皿31

二、塑料器皿32

第四节 培养器皿的清洗与消毒32

一、清洗32

（一）玻璃器皿的清洗33

（二）橡胶制品的清洗33

（三）塑料制品的清洗33

（四）G6除菌滤器的清洗34

（五）不锈钢除菌滤器的清洗34

（六）包装34

二、消毒和灭菌34

（一）物理消毒法35

（二）化学消毒法36

（三）抗生素消毒法37

第五节 培养物的常用固定、染色方法37

一、培养物的常用固定方法38

二、染色方法39

（一）Giemsa染色法40

（二）苏木精-伊红（HE）染色法40

（三）Feulgen染色法41

（四）吖啶橙染色法41

（五）免疫荧光染色法41

（六）免疫金银技术41

（七）ABC免疫酶标技术——DAB显色法42

（八）ABC免疫酶标技术——发光底物显色法43

第六节 光学显微镜术观察的一般过程43

一、光学显微镜的成像原理、构造与性能43

二、光学显微镜的种类44

三、光学显微镜术观察的一般过程45

（一）普通光学显微镜（normal microscope）技术45

（二）相差显微镜（phase contrast microscope）技术45

（三）荧光显微镜（fluorescence microscope）技术45

（四）暗视野显微镜（dark field microscope）技术50

（五）偏振光显微镜（polarizing microscope）技术51

（六）干涉显微镜（interfference microscope）技术51

（七）扫描隧道显微镜（scanning tunneling microscope，STM）技术51

（八）原子力显微镜（atomic force microscope，AFM）技术52

（九）视频显微镜（video microscope，VM）技术52

（十）激光共聚焦扫描显微镜（confocal laser scanning microscope，CLSM）技术52

第七节 电子显微镜术观察的一般过程53

一、透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）技术53

（一）样品制备53

（二）观察方法55

二、扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）技术56

（一）样品制备56

（二）观察方法57

三、超高压电子显微镜（ultra-high-voltage electron microscope，UHVEM）技术57

四、扫描式透射电子显微镜（scanning transmission electron microscope，STEM）技术58

第八节 细胞培养中常用的特殊染色方法58

一、培养细胞的活体染色方法58

二、细胞内糖类染色方法——过碘酸席夫反应法（periodic acid Schiff reaction，PAS）58

三、细胞的脂类染色方法——苏丹红Ⅲ染色法59

四、细胞骨架的染色方法59

（一）微丝的显示方法59

（二）微管的显示方法60

五、Feulgen反应显示DNA60

六、甲基绿-派若宁法（methyl green-pyronin method）显示DNA和RNA61

七、DNA与RNA的吖啶橙荧光染色法61

第九节 培养物的污染及防止62

一、污染途径62

二、污染对培养细胞的影响及污染的检测62

（一）细菌污染对培养细胞的影响及污染物的检测63

（二）真菌污染对细胞的影响及污染物的检测63

（三）支原体污染对细胞的影响及污染物的检测63

（四）病毒污染对细胞的影响及污染物的检测65

（五）细胞交叉污染对细胞的影响及污染物的检测66

三、污染的预防66

四、污染的排除66

第四章 体外培养的基本组织69

第一节 上皮组织69

一、内皮细胞的培养69

（一）血管内皮细胞（vascular endothelial cell）的培养69

（二）淋巴管内皮细胞（lymphatic endothelial cell）的培养73

二、单层柱状上皮细胞的培养76

（一）胃粘膜上皮细胞的培养76

（二）肠粘膜上皮细胞的培养77

三、假复层纤毛柱状上皮细胞的培养78

四、复层扁平上皮细胞的培养80

（一）表皮细胞（epidermal cell）的培养80

（二）食管粘膜上皮细胞的培养82

第二节 结缔组织83

一、成纤维细胞的培养83

（一）消化分离法83

（二）植块培养法84

二、巨噬细胞的培养85

（一）腹膜腔巨噬细胞（peritoneal macrophage）培养法85

（二）肺泡巨噬细胞（alveolar macrophage）的培养86

三、脂肪细胞的培养86

（一）大鼠前脂肪细胞的培养87

（二）小鼠前脂肪细胞的培养87

四、肥大细胞的培养88

（一）皮肤肥大细胞的培养88

（二）肺肥大细胞的培养89

（三）肠肥大细胞的培养90

五、血细胞的培养91

（一）Ficoll-Hypaque分离法91

（二）Percoll分离法92

六、淋巴细胞的培养93

（一）淋巴液中淋巴细胞的培养93

（二）淋巴结中淋巴细胞的培养94

（三）血液中淋巴细胞的培养94

七、软骨细胞的培养95

（一）关节软骨细胞的短期培养95

（二）关节软骨细胞的长期培养95

八、骨细胞的培养96

（一）骨内成骨细胞的培养96

（二）膜内成骨细胞的培养97

第三节 肌肉组织98

一、心肌细胞的培养98

二、平滑肌细胞的培养99

三、骨骼肌细胞的培养101

（一）鸟类骨骼肌细胞的培养101

（二）啮齿类骨骼肌细胞的培养101

第四节 神经组织102

一、神经元的培养102

二、神经胶质细胞的培养103

（一）星形胶质细胞（astrocyte）的培养104

（二）少突胶质细胞（oligodendrocyte）的培养104

（三）施万细胞（Schwann cell）的培养105

第五节 细胞运动的观察106

一、噬动轨迹法106

二、细胞刮除法107

三、细胞培养池法108

四、数字影像法108

第六节 细胞培养的生长测定109

一、细胞计数法109

二、台盼蓝染色法111

三、MTT比色法111

四、细胞生长曲线法112

五、［3H］-TdR掺入法113

六、BrdU掺入法113

第七节 细胞的冻存、复苏和运输115

一、细胞的冻存115

二、细胞的复苏116

三、细胞的运输116

第五章 细胞建系和鉴定118

第一节 正常细胞系的建立和鉴定118

一、正常细胞系建立程序119

（一）原代培养119

（二）传代换液122

（三）细胞的冻存和复苏124

二、正常细胞系建立的例证125

（一）角质表皮细胞（epidernal keratinocytes）建系125

（二）成纤维细胞培养和建系126

（三）建立正常细胞系的讨论和小结127

三、正常细胞系的鉴定127

（一）形态学127

（二）细胞染色体分析128

（三）同工酶检查129

（四）DNA指纹技术（DNA fingerprinting）检测130

（五）抗原标记131

（六）细胞生长实验132

四、正常细胞系建立和鉴定讨论及小结132

第二节 癌细胞系、转化细胞系的建立和鉴定132

一、癌细胞系的建立133

（一）癌细胞原代培养133

（二）换液与传代134

二、癌细胞建系的例证135

三、转化细胞系建立136

四、癌细胞和转化细胞建系讨论和小结138

五、癌细胞系和转化细胞系的鉴定138

（一）细胞形态学139

（二）染色体异常139

（三）体外生长异常140

（四）裸鼠移植瘤试验143

六、癌细胞和转化细胞系建立和鉴定的小结及讨论144

第六章 细胞周期分析与细胞克隆化技术145

第一节 细胞周期的概念145

第二节 细胞同步化方法146

一、材料147

二、方法147

（一）使细胞同步化在G0/G1期方法147

（二）使细胞同步化在G1期148

（三）使细胞同步化在G1/S期交界点148

（四）使细胞同步化在有丝分裂期（M期）149

三、细胞同步化的分析149

第三节 细胞周期分析方法150

一、3H-脱氧脲嘧啶掺入法150

二、测定核酸含量法150

三、BrdU掺入法151

四、PCNA法151

五、Ki-67法151

六、测定生化活动法152

七、其他方法153

第四节 细胞克隆的概念及常用方法154

一、克隆的基本概念154

二、细胞克隆培养方法154

（一）软琼脂培养154

（二）甲基纤维素半固体培养155

（三）有限稀释法155

（四）毛细管吸取单细胞156

（五）影响克隆形成率的因素156

第七章 器官培养157

第一节 器官培养的要求158

一、器官培养的取材158

二、培养基158

三、培养环境中的气体159

四、培养器官的支持物159

第二节 器官培养技术的特点160

一、优点160

二、不足160

第三节 器官培养的方法160

一、固体培养基器官培养法161

（一）表玻璃器官培养法（watch glass technique）161

（二）琼脂凝胶器官培养法（Wolff器官培养法）161

二、液体培养基器官培养法162

（一）擦镜纸器官培养法162

（二）金属格栅器官培养法（Trowell technique）163

（三）琼脂小岛器官培养法164

（四）Transwell器官培养法165

三、动态器官培养法165

（一）灌流式器官培养法165

（二）旋转管培养法（roller tube culture）166

（三）摇摆式器官培养法166

四、体内器官培养法168

（一）鸡胚尿囊绒膜培养法168

（二）早期鸡胚胚盘培养法169

第四节 器官培养的应用170

一、器官培养在胚胎发育研究中的应用170

（一）胚胎肢芽的器官培养170

（二）胚胎性腺的器官培养171

（三）胚胎器官的上皮与间充质的联合培养172

（四）全胚胎培养173

二、器官培养在器官功能及其代谢研究中应用175

（一）骨的器官培养175

（二）血管的器官培养176

（三）肝脏的器官培养177

（四）毛囊的器官培养177

（五）胃肠粘膜的器官培养178

三、器官培养在肿瘤侵袭研究中的应用179

（一）单细胞侵袭器官培养法1——半固体培养基培养法179

（二）单细胞侵袭器官培养法2——液体培养基培养法180

（三）瘤细胞球体器官培养法1——静止球体培养法181

（四）瘤细胞球体器官培养法2——旋转球体培养法181

（五）单层细胞器官培养法182

第八章 干细胞的培养184

第一节 胚胎干细胞184

一、胚胎干细胞的培养185

（一）小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的培养和制备185

（二）利用小鼠成纤维细胞系作为饲养层细胞186

（三）小鼠胚胎成纤维细胞或STO滋养板的制备186

（四）胚胎干细胞的培养187

（五）ES细胞的冻存188

（六）ES细胞的复苏188

（七）ES细胞系的建立189

（八）ES细胞系的常规培养189

二、胚胎干细胞的形态特征及其鉴定191

（一）胚胎干细胞的形态特征191

（二）胚胎干细胞的鉴定191

三、胚胎干细胞的体外诱导分化192

第二节 神经干细胞192

一、神经干细胞的概念及生物学特征193

二、神经干细胞的分离与培养193

（一）胚胎干细胞体外诱导分化为神经细胞194

（二）成体神经干细胞培养及诱导分化195

（三）神经干细胞的诱导分化196

（四）神经细胞形态特征及化学标志196

三、影响神经干细胞分化的因素196

（一）体外定向诱导ES细胞分化为神经细胞196

（二）成体神经干细胞的体外诱导分化197

（三）神经干细胞的体内分化197

（四）移植细胞的标记、存活、迁移与分化197

第三节 造血干细胞198

一、造血干细胞的定义及生物学特征198

二、造血干细胞的分离及培养198

（一）骨髓造血干细胞198

（二）外周血干细胞199

（三）脐带血干细胞199

（四）胎儿造血系统199

（五）胚胎干细胞和胚胎原始生殖细胞200

（六）造血干细胞的可塑性200

第四节 间充质干细胞200

一、从骨髓细胞中分离MSC细胞200

二、分离骨髓基质细胞（MDSC）200

三、流式细胞仪分离MSC和MDSC201

四、骨髓细胞长期培养（LTBMC）201

五、人的MSC细胞系培养202

六、MSC细胞向脂肪细胞谱系分化202

七、MSC诱导分化为软骨细胞-软骨细胞团试验203

八、MSCS诱导分化为成骨细胞谱系203

第五节 表皮组织干细胞204

第六节 胰岛干细胞205

一、从人胰腺导管制备胰岛干细胞206

二、从小鼠胚胎干细胞系定向诱导分化为胰岛干细胞207

第七节 鉴定干细胞及分化细胞类型的标志207

第九章 细胞培养在细胞分化研究中的应用212

第一节 细胞分化概念212

一、细胞分化的特征212

二、细胞分化的调控213

（一）影响细胞分化的作用方式213

（二）影响细胞分化的活性物质214

三、细胞分化的分子机制215

四、细胞分化的调控障碍与疾病215

（一）畸胎瘤215

（二）恶性肿瘤216

第二节 正常细胞的分化研究217

一、正常细胞分化研究简况217

二、ES和EG细胞培养和建系的基本技术218

（一）饲养层细胞218

（二）胚胎细胞来源218

（三）ES和EG细胞的培养过程218

（四）ES和EG细胞系特性和鉴定220

三、ES细胞体外诱导分化221

（一）ES细胞体外诱导分化的意义221

（二）ES细胞体外诱导分化的基本原理222

（三）ES细胞体外诱导分化的基本方法222

（四）ES细胞体外分化的细胞类型223

四、诱导分化细胞的永生化225

五、小鼠骨髓和脾来源树突状细胞的分离与扩增培养226

第三节 癌细胞分化研究228

一、癌细胞分化研究的简况228

二、癌细胞分化研究228

（一）HL-60细胞分化诱导实验228

（二）肝癌Bel 7402细胞分化诱导实验233

（三）神经母细胞瘤LA-N-5细胞的分化诱导试验方法234

（四）小鼠黑色素瘤B16细胞的分化诱导实验235

三、癌细胞分化研究几种常用的检测技术236

（一）免疫荧光法——检测横纹肌肉瘤分化抗原myosin236

（二）流式细胞术——检测肿瘤细胞生物分子表达的改变237

（三）研究肿瘤细胞代谢的31PNMR谱测定238

第十章 细胞培养在细胞衰老、凋亡研究中的应用240

第一节 细胞凋亡的常用研究方法240

一、细胞凋亡的形态学研究方法240

（一）凋亡细胞的姬姆萨染色240

（二）凋亡细胞的电子显微镜观察241

（三）凋亡细胞的碘化丙锭（PI）排斥分析法241

（四）双苯并咪唑染料（Ho）活细胞吸收分析法242

（五）凋亡细胞对胰蛋白酶和脱氧核糖核酸酶敏感性分析法243

二、细胞凋亡的生物化学研究方法243

（一）超速离心法243

（二）琼脂糖凝胶电泳法244

（三）末端标记电泳法245

三、细胞凋亡的免疫化学分析方法247

四、细胞凋亡的分子生物学研究方法249

（一）TUNEL法249

（二）缺口翻译法250

五、细胞凋亡时Ca2+浓度测定252

第二节 抗凋亡研究253

一、bcl-2基因的抗凋亡作用253

二、细胞抗凋亡的信号转导通路254

第三节 细胞衰老的常用研究方法255

一、端粒长度的测定256

二、错配修复基因的测定257

三、微卫星不稳定性的测定258

第十一章 细胞融合与单克隆抗体制备260

第一节 单克隆抗体制备的基本原理261

第二节 小鼠-小鼠B淋巴细胞杂交瘤263

一、融合用细胞的制备263

二、细胞融合267

三、杂交瘤细胞的选择培养268

四、特异抗体的检测269

五、杂交瘤细胞的克隆化272

六、杂交瘤细胞的冻存273

七、单克隆抗体的大量制备274

八、单克隆抗体Ig类型的鉴定274

九、小鼠单克隆抗体的纯化275

第三节 人-人淋巴细胞杂交瘤与人-鼠杂交瘤细胞277

一、人-人淋巴细胞杂交瘤技术277

二、人-小鼠B淋巴细胞杂交瘤技术279

第四节 大鼠-大鼠B淋巴细胞杂交瘤279

一、大鼠骨髓瘤细胞系280

二、大鼠B淋巴细胞的制备280

三、细胞融合280

四、大鼠单克隆抗体的生产280

五、大鼠单克隆抗体的提纯280

第五节 基因工程抗体281

一、人-鼠嵌合抗体（human-mouse chimericantibodies）281

二、小分子抗体282

三、双特异性抗体283

四、噬菌体抗体283

第十二章 细胞培养的应用285

第一节 细胞培养在分子生物学中应用285

一、分离提取研究285

二、基因导入291

三、原位检测研究296

第二节 细胞培养在生物工程中的应用298

一、大规模细胞培养的体系参数300

二、大规模细胞培养的工艺类型300

三、大规模细胞培养方法301

第三节 细胞培养在生物制品中的应用305

一、生物制品的概念305

二、细胞培养在疫苗制备中的应用305

第四节 细胞培养在药物开发中的应用307

第五节 细胞培养在临床中的应用316

一、细胞培养在临床诊断中的应用316

二、细胞培养在临床治疗中的应用318

附录Ⅰ实验室常用的细胞系株324

附录Ⅱ-1常用缓冲液327

附录Ⅱ-2其他缓冲液的配制328

附录Ⅲ常用人工合成细胞培养基330

索引331