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第一篇 生物化学与分子生物学实验技术基本理论第一章 生物大分子制备技术3

第一节 概述3

一、生物大分子制备的特点3

二、生物大分子制备的方法和步骤3

三、生物大分子制备过程中的分析和鉴定4

四、生物大分子分离纯化的方法4

第二节 生物大分子制备的前处理4

一、生物材料的选择4

二、细胞破碎的方法5

三、生物大分子的提取6

第三节 生物大分子的分离纯化8

一、沉淀8

二、透析12

三、超滤13

四、超临界流体萃取14

五、萃取与相分离16

六、结晶16

七、冰冻干燥17

八、分离纯化方法的选择18

第四节 生物大分子样品的保存18

一、影响生物大分子样品保存的主要因素18

二、蛋白质和酶等生物大分子样品的保存方法19

第二章 分光光度技术21

第一节 基本原理21

一、光谱21

二、分子能态21

三、吸收光谱曲线22

四、紫外光谱中常用的术语23

五、光吸收定律24

第二节 分光光度计的组成、构造和类型25

一、分光光度计的组成25

二、分光光度计的构造25

三、紫外-可见分光光度计的类型28

四、分光光度法在生物化学和分子生物学实验技术中的应用28

第三章 电泳技术30

第一节 基本理论30

一、电泳发展的历史30

二、电泳装置30

三、电泳的基本原理31

四、影响电泳分离的主要因素32

第二节 电泳的分类33

一、电泳的分类33

二、生物化学和分子生物学实验中常用的电泳34

第三节 常用电泳支持介质和染色方法45

一、常用电泳支持介质45

二、染色方法46

第四章 离心技术49

第一节 离心技术基本原理49

一、离心力49

二、相对离心力49

三、沉降系数50

四、沉降速度50

五、沉降时间50

六、相对分子量50

第二节 离心设备51

一、离心机的主要类型和构造51

二、制备性超速离心的分离方法和离心操作的注意事项53

第五章 层析技术57

第一节 层析技术概述57

一、层析技术的发现与发展57

二、层析技术的应用范围57

三、层析技术的分类58

四、层析技术的术语59

第二节 层析技术基本理论61

一、分离现象61

二、塔板理论62

三、速率理论63

四、分辨率64

第三节 吸附层析65

一、吸附层析的基本原理65

二、吸附介质的分类及其性质66

三、吸附层析技术69

第四节 凝胶层析71

一、凝胶层析的基本原理71

二、凝胶层析的基本概念72

三、凝胶的种类和性质74

四、凝胶的选择、处理和保存76

五、凝胶层析的基本操作77

六、凝胶层析的应用78

第五节 离子交换层析79

一、离子交换层析的基本原理79

二、离子交换剂的种类和性质80

三、离子交换剂的选择、处理和保存82

四、离子交换层析的基本操作83

五、离子交换层析的应用84

第六节 亲和层析85

一、亲和层析的基本原理86

二、亲和吸附剂86

三、亲和层析的基本操作90

四、亲和层析的应用91

第六章 核酸的分离纯化技术94

第一节 概述94

一、核酸的理化性质94

二、DNA提取的几种方法94

第二节 核酸的分离、纯化和鉴定95

一、质粒DNA的分离、纯化和鉴定95

二、基因组DNA的提取98

三、RNA提取操作中的一般要求98

四、DNA酶切及凝胶电泳99

第七章 DNA重组技术102

第一节 工具酶103

一、限制性核酸内切酶的概念103

二、限制性核酸内切酶的命名104

三、限制性核酸内切酶的分类104

四、限制性核酸内切酶的作用104

第二节 基因工程载体105

一、质粒载体106

二、噬菌体载体107

三、动物病毒载体109

第三节 目的序列与载体的连接109

一、粘性末端连接109

二、平末端连接111

第四节 目的基因序列的来源和分离111

一、基因组DNA文库111

二、cDNA文库112

三、聚合酶链式反应113

四、人工化学合成114

第五节 基因序列导入细胞114

一、转化114

二、感染114

三、转染114

第六节 目的基因序列克隆的筛选与鉴定115

一、根据重组载体的标志作筛选115

二、核酸杂交法115

三、PCR法116

四、免疫学方法116

五、DNA限制性内切酶图谱分析116

六、核苷酸序列测定116

第七节 克隆基因的表达116

第八章 分子杂交技术119

第一节 DNA的变性与复性119

一、DNA的变性119

二、DNA的复性121

第二节 放射性同位素标记核酸探针122

一、缺口平移法122

二、末端标记法122

三、应用特异单引物法标记DNA探针122

四、双引物法标记DNA探针122

五、聚合酶链式反应（PCR）标记高活性DNA探针123

第三节 非放射性标记的核酸探针123

一、生物素标记核酸探针方法123

二、光敏生物素标记核酸探针124

三、生物素-补骨脂素标记法125

四、生物素-α-氨基乙酸-N-羟基琥珀酰标记化学修饰的DNA法125

五、缺口平移法标记生物素DNA探针125

六、生物素随机引物标记探针方法125

七、异羟基洋地黄毒甙（Digoxigenin）标记核酸探针126

八、光敏2,4-二硝基苯（光敏DNP）标记DNA法126

九、三硝基苯磺酸（TNBS）标记核酸探针126

十、生物素化的RNA探针标记126

十一、辣根过氧化物酶标记核酸探针法127

十二、用聚合酶链式反应标记高活性DNA探针127

第四节 几种常见的核酸分子杂交方法127

一、Southern杂交128

二、Northern杂交129

三、菌落原位杂交129

四、斑点杂交129

五、杂交反应的条件及参数的优化130

第九章 聚合酶链式反应（PCR）技术131

第一节 PCR技术的原理131

第二节 PCR反应体系的组成131

一、PCR反应体系的组成131

二、电泳分析133

三、PCR操作范例133

第三节 影响PCR的主要因素135

一、温度循环参数135

二、引物设计136

三、DNA聚合酶137

四、影响PCR特异性的因素139

五、扩增平坡140

第四节 PCR各种应用模式140

一、兼并引物PCR140

二、套式引物PCR141

三、复合PCR141

四、反向PCR141

五、不对称PCR142

六、标记PCR和彩色PCR142

七、加端PCR142

八、锚定PCR或固定PCR143

九、玻片PCR143

十、反转录PCR方法检测RNA143

十一、定量PCR144

第五节 样品处理与注意事项145

一、样品处理145

二、注意事项146

第六节 PCR仪器的发展147

第七节 其他链扩增技术及应用范围148

一、免疫PCR148

二、转录依赖的扩增系统（TAS）149

三、再生式序列复制技术149

四、连接酶链式反应（LCR）150

五、PCR-SSCP分析技术150

第十章 DNA序列测定技术151

第一节 测序原理与策略151

一、Sanger双脱氧链终止法151

二、Maxam-Gilbert DNA化学降解法154

三、测序策略154

第二节 非同位素银染测序系统和T7 DNA聚合酶测序技术157

一、非同位素银染测序系统157

二、T7 DNA聚合酶测序技术157

第三节 DNA序列分析的自动化和杂交测序法158

一、DNA序列分析的自动化158

二、DNA杂交测序法（SBH）159

第十一章 生物芯片技术162

第一节 生物芯片及应用简介162

一、生物芯片162

二、应用领域162

第二节 生物芯片的制作165

一、点样设备166

二、芯片片基167

三、点样样品168

第三节 图像的采集和分析176

一、磷感屏成像系统176

二、荧光芯片扫描仪177

三、基因芯片上各克隆荧光信号的分析原理177

四、Microarray数据分析178

第四节 生物芯片（DNA微阵列）荧光扫描仪中的激光共聚焦扫描技术179

一、微阵列的相关特性179

二、微阵列扫描仪180

三、激光共聚焦扫描仪182

第二篇 生物化学与分子生物学实验187

第一章 生物化学实验187

实验一 3,5-二硝基水杨酸比色定糖法187

实验二 粗脂肪的定量测定（Soxhlet提取法）189

实验三 蛋白质和氨基酸的呈色反应191

实验四 蛋白质的沉淀、变性反应196

实验五 聚丙烯酰胺等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点199

附 pH法测定蛋白质的等电点205

实验六 Folin-酚法测定血清蛋白质含量206

附1 双缩脲法测定蛋白质含量208

附2 考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量209

实验七 紫外吸收法测定蛋白质含量210

实验八 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量212

实验九 凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量218

实验十 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳223

实验十一 吸附层析法分离制备细胞色素C229

实验十二 菜花（花椰菜）中核酸的分离和鉴定231

实验十三 定磷法测定核酸浓度233

附1 RNA的定量测定（苔黑酚法）237

附2 DNA的定量测定（二苯胺法）238

实验十四 紫外线（UV）吸收法测定核酸含量239

实验十五 薄层层析法分离AMP、ADP和ATP241

实验十六 离子交换柱层析分离核苷酸243

实验十七 酶的特性249

实验十八 酯酶同功酶的垂直板不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳分析252

实验十九 超氧化物歧化酶的分离纯化255

实验二十 亲和层析法纯化胰蛋白酶259

实验二十一 饱食、饥饿及激素对肝糖原含量的影响265

第二章 分子生物学实验268

实验一 植物组织基因组DNA的提取268

实验二 动物组织基因组DNA的提取270

实验三 细菌基因组DNA的制备271

实验四 DNA定量和电泳检测272

实验五 质粒DNA的碱裂解法提取与纯化273

实验六 DNA酶切及凝胶电泳276

实验七 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化279

实验八 动植物组织mRNA提取281

实验九 植物病毒RNA提取283

实验十 重组质粒的连接、转化及筛选284

实验十一 RFLP技术287

实验十二 RAPD技术289

实验十三 聚合酶链式反应（PCR）291

实验十四 Southern杂交294

实验十五 Northern杂交296

实验十六 菌落原位杂交298

实验十七 斑点杂交300

实验十八 非同位素银染测序系统操作技术301

实验十九 T7 DNA聚合酶测序技术308

第三篇 附录317

附录一 实验室安全及防护知识317

一、实验室安全知识317

二、实验室灭火法318

三、实验室急救319

附录二 实验室基本操作319

一、玻璃仪器的清洗319

二、塑料器皿的清洗320

三、洗液的配制320

四、其他洗涤液320

五、玻璃和塑料器皿的干燥320

六、移液320

七、缓冲液与pH值的测定322

附录三 实验记录与实验报告324

一、实验记录324

二、实验报告325

附录四 实验误差与提高实验准确度的方法325

一、实验误差325

二、误差来源326

三、提高实验准确度的方法327

附录五 常用酸碱指示剂的配制327

附录六 常用缓冲溶液的配制方法328

一、甘氨酸-盐酸缓冲液（0.05mol/L）328

二、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（0.05mol/L）328

三、邻笨二甲酸氢钾-盐酸缓冲液（0.05mol/L,20℃）328

四、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液329

五、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液329

六、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.1mol/L）330

七、乙酸-乙酸钠缓冲液（0.2mol/L,18℃）330

八、磷酸盐缓冲液330

九、巴比妥纳-盐酸缓冲液（18℃）332

十、Tris-盐酸缓冲液（0.05mol/L,25℃）332

十一、硼砂-硼酸缓冲液（0.2mol/L硼酸根）332

十二、硼砂-盐酸缓冲液（0.05mol/L硼酸根）333

十三、硼砂-氢氧化钠缓冲液（0.05mol/L硼酸根）333

十四、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（0.1mol/L）333

附录七 Union Carbide各种型号透析管的渗透范围334

附录八 Sepctro por再生纤维素膜透析袋数据334

附录九 纤维素酯膜透析袋的数据336

附录十 Amicon圆形超滤膜的规格和有效过滤面积的数据337

附录十一 Amicon圆形超滤膜的流速337

附录十二 常用蛋白质分子量标准参照物337

附录十三 凝胶数据表338

一、Sephadex G型交联葡聚糖凝胶的数据338

二、Sephadex G型交联葡聚糖凝胶溶胀所需时间339

三、琼脂糖凝胶的数据339

四、Superose的数据340

五、琼脂糖凝胶Bio-Gel A型的数据340

六、Bio-Gel P型凝胶的数据341

七、交联聚苯乙烯凝胶Bio-Beads S-X型的数据341

八、制备级Superdex凝胶过滤介质的数据342

九、聚乙烯醇型凝胶Toyopearl的数据342

十、各种凝胶所允许的最大操作压343

附录十四 凝胶过滤用标准蛋白344

一、凝胶过滤用低分子质量标准的组成344

二、凝胶过滤用高分子质量标准的组成344

三、凝胶过滤用分子质量标准品344

附录十五 凝胶层析中遇到的故障、原因与排除方法345

附录十六 薄层层析分离各类物质常用的展层溶剂346

附录十七 各类物质常用的薄层显色剂347

附录十八 离子交换纤维素及技术参数348

一、离子交换纤维素348

二、交换层析介质的技术数据348

附录十九 实验室中常用酸碱的比重和浓度349

附录二十 硫酸铵饱和度的常用表350

一、调整硫酸铵溶液饱和度计算表（25℃）350

二、调整硫酸铵溶液饱和度计算表（0℃）350

附录二十一 常见蛋白质分子量参考值351

附录二十二 蛋白质等电点参考值352

附录二十三 离心机转速和离心力的列线计算图354

一、低速转子的相对离心力列线图354

二、高速转子的相对离心力列线图355

附录二十四 分子生物学常用溶液、培养基的配制方法355

一、常用贮液与溶液355

二、电泳缓冲液、染料和凝胶加样液359

三、常用培养基361

四、常用抗生素362

参考文献364