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第一章　组织制片技术与细胞化学技术1

第一节　组织制片技术1

一、取材1

二、固定2

三、脱水与透明8

四、包埋8

五、切片10

六、染色11

七、封片16

八、非切片法组织标本制作技术16

第二节　常用组织化学与细胞化学的技术方法17

一、碳水化合物显色方法17

二、核酸显色方法19

三、蛋白质显色方法20

四、脂类显色方法21

五、无机成分显色方法23

六、酶组织化学显色方法25

第三节　放射自显影技术31

一、放射自显影像制备31

二、放射自显影分辨力、效率、本底、类型、复制与阅读35

三、放射自显影基本技术方法37

四、放射自显影的应用40

五、放射自显影技术注意事项45

第四节　细胞凋亡检测技术46

一、吖啶橙荧光染色法47

二、Hoechst 33258染色法47

三、末端脱氧核糖核酸转移酶介导地高辛缺口末端标记法47

四、凝胶电泳检测法48

五、流式细胞仪检测法48

六、透射电子显微镜检测法49

七、其他检测方法49

第二章　免疫细胞化学技术51

第一节　免疫细胞化学概述51

一、免疫细胞化学技术发展简史51

二、免疫细胞化学的相关概念52

三、免疫细胞化学技术中的抗体命名53

四、免疫细胞化学技术的基本过程与分类53

五、免疫细胞化学技术的优点54

六、免疫细胞化学技术中的抗体54

第二节　酶免疫细胞化学技术的基本原理58

一、用于标记的酶58

二、直接法59

三、间接法59

四、非标记抗体法60

五、酶标记抗体法62

第三节　酶免疫细胞化学操作技术64

一、切片的准备64

二、抗体的配制68

三、对照实验68

四、染色操作69

五、各种方法的敏感性76

六、免疫阳性结果的判定77

七、免疫细胞化学双重／多重染色技术78

八、金属离子对免疫细胞化学染色的影响83

第四节　荧光免疫细胞化学技术84

一、用于标记的荧光染料84

二、荧光免疫细胞化学技术中的非特异荧光85

三、荧光免疫细胞化学染色技术的分类与染色步骤87

四、荧光免疫细胞化学双重／多重染色技术89

五、荧光免疫细胞化学技术的一些进展89

第五节　免疫细胞化学染色的有关注意事项93

一、常见问题及其处理办法93

二、同种属一抗用于同种属动物的免疫细胞化学染色96

第三章　原位杂交组织化学技术100

第一节　原位杂交组织化学技术的基本原理和方法100

一、基本原理100

二、基本方法101

第二节　核酸探针的种类、制备及标记108

一、探针的种类和制备109

二、探针的标记110

第三节　不同探针在原位杂交组织化学中的应用117

一、cRNA探针在原位杂交组织化学中的应用117

二、DNA及寡核苷酸技术在原位杂交组织化学中的应用120

第四节　原位杂交组织化学与免疫细胞化学双标技术121

一、放射性核素原位杂交组织化学与免疫组织化学双标记法122

二、非核素原位杂交组织化学与免疫组织化学双标记法123

第五节　荧光原位杂交细胞化学技术124

一、DNA探针应用于FISH中的基本原则125

二、FISH基本操作方法125

三、细胞核混悬液的FISH127

四、染色体的FISH128

第六节　原位杂交细胞化学技术的一些新进展129

一、原位PCR129

二、原位启动标记法131

三、肽-核酸原位杂交细胞化学技术132

四、组织芯片定量原位杂交技术133

五、锁链探针原位杂交技术133

第七节　原位杂交在细胞增殖、凋亡检测中的应用134

一、组蛋白mRNA原位杂交检测细胞增殖134

二、原位标记DNA片段检测细胞凋亡136

第八节　整胚原位杂交139

第四章　电子显微镜技术144

第一节　透射电镜144

一、透射电镜的基本原理144

二、超薄切片技术146

三、微波辐射快速制样技术153

四、负染色技术154

第二节　扫描电镜技术155

一、扫描电镜概况155

二、扫描电镜的生物样品制备156

第三节　冷冻电镜制样技术162

一、冷冻固定原理162

二、快速冷冻方法162

三、冷冻复型样品制备163

四、冷冻超薄切片法164

第四节　电镜细胞化学技术166

一、电镜酶细胞化学基本原理166

二、样品制备程序166

三、常用电镜酶细胞化学方法168

第五节　免疫电镜技术174

一、概述174

二、酶标免疫细胞化学电镜技术178

三、胶体金标记免疫电镜技术184

四、铁蛋白标记免疫电镜技术194

五、双标免疫电镜技术196

第六节　电镜原位杂交技术204

一、电镜原位杂交技术概述204

二、几种电镜原位杂交技术的操作步骤207

第五章　激光扫描共聚焦显微技术213

第一节　激光扫描共聚焦显微技术的基本原理213

一、共聚焦技术的发展213

二、激光扫描共聚焦显微镜216

三、激光扫描共聚焦显微镜成像模式220

四、样本制备和图像采集221

第二节　激光扫描共聚焦显微镜在生物领域的应用235

一、细胞内钙离子测定236

二、细胞内pH的测定246

三、细胞断层扫描和三维重建251

四、膜电位的测定254

五、荧光漂白恢复技术256

六、笼锁化合物技术259

第六章　细胞形态定量分析技术265

第一节　基本概念266

一、二维图像与三维结构之间的关系266

二、几何探针267

三、卡瓦列里原理268

第二节　细胞数的体视学定量研究271

一、随机抽样271

二、从轮廓数估计细胞数274

三、细胞的直接计数278

第三节　成功应用的举例283

第七章　细胞化学定量分析技术286

第一节　概论286

一、基本概念与定义286

二、计量细胞化学物质量的过程288

三、细胞化学定量分析中的误区与陷阱288

四、细胞化学计量术的评定291

第二节　显微光度测量术295

一、概述295

二、显微吸收光度术295

三、显微荧光光度术298

第三节　显微分光光度计300

一、测量方法300

二、吸收光度测量300

三、荧光光度测量300

第四节　显微图像分析系统301

一、组成301

二、图像处理与分析原理301

三、性能要求302

四、图像分析系统性能的生物学方法评估307

五、测量参数及其意义308

第五节　流式细胞术310

一、流式细胞仪的主要组件310

二、流式细胞仪的原理310

三、流式细胞仪的应用311

四、流式细胞术的质量控制311

第八章　细胞培养及细胞内注射技术313

第一节　细胞培养的基本操作及要求313

一、常用培养器皿的洗消313

二、细胞培养用液的配制314

三、无菌操作的要领和要求315

四、细胞原代培养316

五、细胞传代培养318

六、细胞的冻存与复苏319

第二节　细胞的特殊培养方法320

一、二倍体细胞培养法320

二、支持物培养法320

三、细胞克隆培养320

四、球体细胞培养321

五、微载体细胞培养法321

六、悬浮培养法322

第三节　干细胞的培养方法及免疫标记322

一、小鼠胚胎干细胞体外分离培养322

二、已建系的小鼠胚胎干细胞体外培养325

三、胚胎干细胞的鉴定326

第四节　器官培养方法327

第五节　细胞内注射技术329

一、细胞内注射的类型330

二、细胞内注射操作方法330

三、细胞内注射与细胞化学技术334

第九章　PCR实验技术与方法336

第一节　PCR技术总论336

一、PCR反应体系337

二、PCR的基本操作338

三、PCR的常见问题340

四、PCR的主要应用341

第二节　反转录-聚合酶链式反应341

一、基本原理341

二、常规RT-PCR342

三、一步法RT-PCR344

四、RT-PCR的应用345

第三节　定量PCR345

一、定量PCR的概念345

二、定量PCR的原理345

三、定量PCR的类型346

四、荧光定量PCR347

五、定量PCR常见问题351

六、定量PCR的应用351

第四节　原位PCR352

一、原位PCR的基本原理352

二、原位PCR的分类352

三、原位PCR的基本步骤353

四、原位PCR注意事项354

五、原位PCR的应用355

第五节　单细胞PCR355

一、单细胞PCR的原理356

二、方法和步骤356

三、单细胞PCR注意事项358

四、单细胞RT-PCR的应用358

第十章　蛋白质组基本理论与技术360

第一节 蛋白质研究历史回顾360

一、蛋白质研究的初期阶段360

二、蛋白质研究的发展阶段361

三、蛋白质研究的分子生物学——基因组阶段362

四、蛋白质研究的分子生物学——蛋白质组阶段363

第二节 蛋白质组研究的理论和技术基础364

一、蛋白质分离纯化的理论基础364

二、蛋白质分离纯化的技术基础367

第三节　大鼠皮质额叶双向电泳实例分析370

一、实验原理371

二、实验所需设备、试剂及其配制371

三、实验结果375

四、实验体会375

第四节　快速老化小鼠额叶皮质蛋白组学的考马斯亮蓝染色技术376

一、实验原理376

二、实验所需设备、试剂及其配制377

三、实验结果382

四、实验体会385

附录一　免疫细胞化学常用试剂388

一、缓冲液388

二、固定剂392

三、显色液395

四、黏附剂397

五、封固剂398

六、酶消化液398

七、其他399

附录二　原位杂交组织化学常用试剂及处理402

一、杂交前准备402

二、探针的标记相关试剂405

三、固定剂408

四、杂交前处理相关试剂409

五、杂交用液410

六、杂交后漂洗溶液411

七、原位杂交信号显示412

附录三 图像分析软件在免疫细胞化学中的应用414

第一节　Image Pro Plus软件在图像定量分析中的应用414

一、使用IPP对免疫组织化学DAB显色图像作定量分析414

二、对免疫荧光图像的定量分析423

第二节　NIS-Elements BR在形态学研究中的应用431

一、NIS-Elements BR分析软件的定标431

二、NIS-Elements BR软件对简单目标的几何测量432

三、NIS-Elements BR软件对复杂目标的几何测量436

四、NIS-Elements BR软件测量某区域的目标442

五、NIS-Elements BR分析软件测量荧光强度446

六、NIS-Elements BR分析软件在多通道荧光方面的应用451

附录四 常用计算机统计软件的使用454

第一节　统计软件SPSS简介及使用454

一、SPSS软件简介454

二、SPSS的主要窗口及统计功能454

三、SPSS常用菜单功能简介456

四、SPSS进行统计分析的主要过程458

五、实例分析458

第二节　统计软件Excel简介及使用466

一、Excel简介466

二、Excel的数据处理与统计功能&一466

三、实例分析468

缩略词表475