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第一章 抗体的制备技术1

第一节 多克隆抗体的制备（抗血清的制备技术）1

一、免疫动物的选择1

二、抗原的准备和免疫原的注射剂量1

三、佐剂2

四、免疫方案2

五、免疫效价的检测2

六、抗体的纯化2

七、抗体的保存7

第二 节单克隆抗体的制备（杂交瘤技术）7

一、基本原理7

二、制备过程8

第三 节基因工程抗体技术14

一、人－鼠嵌合抗体15

二、小分子抗体18

三、抗体库技术21

四、基因工程抗体的表达，纯化及活性测定21

第二章 免疫亲和层析技术27

第一节 免疫亲和层析的基本过程27

一、概要27

二、操作步骤28

第二节 免疫亲和层析的主要影响因素29

一、影响免疫亲和层析纯化效果的因素29

二、免疫亲和层析使用的抗体29

第三节 免疫亲和层析的操作方案31

一、免疫亲和层析程序方案概述31

二、抗体亲和层析柱的制备31

三、抗原与抗体－微珠基质的结合37

四、从免疫亲和层析柱上洗脱抗原39

一、样本的制备43

第三章 免疫印迹43

第一节蛋白质的电泳分离43

二、蛋白质凝胶电泳47

第二节 将蛋白质从凝胶中转印至膜上49

一、以PVDF膜为固相载体的半干转印法49

二、转印后切取印迹膜50

三、印迹膜蛋白染色51

第三节 免疫检测51

一、印迹膜上非特异性蛋白质结合位点的封闭52

二、直接与间接检测方法52

第四节 免疫印迹中需要注意的问题54

一、抗体的性质54

二、样品中待检测蛋白质的含量54

三、背景问题54

四、转印效率低55

五、设置对照与解释结果56

六、免疫印迹技术的灵敏度56

第四章 免疫标记技术57

第一节 免疫荧光标记技术57

一、荧光抗体的制备57

二、荧光标记技术的应用60

第二节 免疫酶技术64

一、酶标抗体的制备65

二、酶－抗酶复合物的制备68

三、酶标抗体和酶－抗酶复合物的应用69

第三节 放射性核素标记技术74

一、放射性核素标记74

二、放射性核素标记技术的应用77

一、胶体金的制备81

第四节免疫金标记技术81

二、胶体金标记蛋白的制备82

三、胶体金标记技术的应用84

第五章 免疫学中常用的PCR技术88

第一节 PCR基本原理和标准方法88

一、PCR基本原理88

二、标准PCR方法88

第二节 PCR反应体系的组成及优化90

一、模板90

二、寡聚核苷酸引物90

三、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)91

四、Mg2+的浓度91

五、耐热DNA聚合酶91

七、污染的对策92

六、循环参数92

八、其他优化策略93

九、PCR常见问题及处置93

第三节 PCR反应模板的制备93

一、细菌DNA的制备94

二、全血标本DNA制备94

三、白细胞标本DNA制备95

四、临床拭子标本的DNA制备97

五、固定和包埋的组织标本的DNA制备97

六、微量和特殊标本的DNA制备99

七、体外培养细胞和组织细胞DNA的提取100

八、凝胶中PCR产物的再扩增标本制备101

九、RNA标本的制备102

第四节 PCR产物的检测102

一、凝胶电泳分析法102

二、点杂交103

三、PCR-ELISA法105

第五节 免疫学中的特殊PCR技术106

一、免疫PCR(IM-PCR)106

二、定量PCR109

三、原位PCR(In situPCR)112

第六节 PCR技术在免疫学中应用115

一、PCR在淋巴细胞抗原受体研究中的应用115

二、在HLA分型、细胞因子检测和基因工程抗体的制备中的应用118

第六章 免疫细胞的分离120

第一节 免疫细胞的分离的原理和手段120

一、基于细胞物理性状的分离方法120

二、基于细胞表面标记的分离方法121

第二节 各种免疫细胞的分离与纯化122

一、外周血白细胞的分离和纯化122

二、外周血单个核细胞的分离124

三、淋巴细胞的分离125

四、T淋巴细胞和B淋巴细胞的分离126

五、T细胞亚群的分离129

六、NK细胞的分离132

七、单核细胞分离134

八、人外周血中性粒细胞制备135

九、嗜碱性粒细胞的分离136

十、嗜酸性粒细胞的分离137

十一、组织肥大细胞的分离137

十二、树突状细胞（DC）138

十三、红细胞的分离139

第七章 免疫细胞功能的检测141

第一节 免疫细胞数量的检测141

一、通过检测表面标志（CD分子）检测各类免疫细胞的数量141

二、抗原特异性T细胞数量的检测——MHC／多肽四聚体法145

一、T、B淋巴细胞增殖反应146

第二节 T、B淋巴细胞功能测定146

二、混合淋巴细胞培养148

三、细胞毒性T细胞胞毒功能测定149

四、B细胞功能的测定152

五、LAK/TIL细胞的活性测定155

第三节 NK细胞活性测定157

一、同位素释放法157

二、乳酸脱氢酶释放试验159

第四节 中性粒细胞功能测定160

一、中性粒细胞吞噬功能的测定160

二、中性粒细胞粘附功能的测定160

——琼脂糖平板法161

四、中性粒细胞杀菌功能的检测——全血化学发光测定法161

三、中性粒细胞移动功能的测定161

五、硝基蓝四氮唑（NBT）还原能力的测定162

第五节 单核－巨噬细胞功能测定162

一、单核－巨噬细胞胞毒作用的检测163

二、单核－巨噬细胞趋化功能的检测164

三、巨噬细胞吞噬功能测定——皮泡法165

第六节 嗜碱性粒细胞功能和红细胞免疫功能的测定166

一、嗜碱性粒细胞功能的测定——嗜碱性粒细胞脱颗粒试验166

二、红细胞免疫功能的测定167

第八章 细胞因子及其受体的检测169

第一节 细胞因子的生物活性检测法169

一、IL-1的生物活性检测法170

二、IL-2的生物活性检测法175

三、TNF的生物活性检测法179

一、TNF的免疫学检测法181

第二节 细胞因子及其受体的免疫学检测法181

二、IL-2R的免疫学检测法184

三、细胞内（胞浆）细胞因子的免疫学检测法188

第三节 细胞因子的分子生物学检测法189

一、斑点杂交法测定培养细胞IL-2 mRNA的含量189

二、原位杂交法测定TNF的mRNA196

三、反转录PCR（RT-PCR）定量检测细胞因子的mRNA198

第九章 细胞凋亡的检测方法200

第一节 细胞凋亡的形态学检测方法200

一、普通光学显微镜检测法200

二、荧光显微镜检测法202

三、电子显微镜检测法207

四、凋亡指数和细胞活力的定量测定（荧光染色法）207

一、基于细胞凋亡时DNA变化的检测方法208

第二节 细胞凋亡检测的生物化学方法208

二、基于凋亡诱导蛋白酶变化的细胞凋亡检测209

第三节 免疫学方法（ELISA）211

第四节 原位末端转移酶标记技术212

一、荧光标记法212

二、酶标记法213

第五节 靶细胞DNA片段的定量分析与杀伤细胞介导的细胞溶解试验214

第六节 流式细胞分析术检测细胞凋亡215

一、流式细胞分析术检测细胞凋亡的基本原理215

二、流式细胞分析术检测细胞凋亡的常用方法216

第七节 细胞凋亡的相关蛋白分析219

一、Fas抗原的检测219

二、Bcl-2原癌基因的检测221

三、P53蛋白检测222

一、标本基因组DNA提取225

第一节 PCR-SSO HLA分型技术225

第十章 HLA分型技术225

二、HLA等位基因序列特异性探针（SSO）及其标记226

三、PCR扩增标本的HLA-DR基因228

四、扩增DNA固定于尼龙膜上228

五、预杂交和杂交229

六、洗膜229

七、结果显示230

八、结果分析230

第二节 PCR-RFLP HLA分型技术230

一、待测样本基因组DNA的提取232

二、PCR扩增样本DNA的HLA基因片段232

三、PCR扩增产物的RFLP分析233

四、结果分析234

二、PCR-SSP扩增体系的组成和准备235

一、标本基因组DNA提取235

第三节 PCB-SSP HLA分型技术235

三、PCR-SSP扩增237

四、琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物238

五、结果分析238

第四节 常用HLA DNA分型技术的特点和选用239

一、常用HLA DNA分型技术的特点239

二、常用HLA DNA分型技术的选用240

第十一章 T细胞克隆技术和HLA／抗原肽四聚体制备技术241

第一节 T细胞克隆技术241

一、抗原特异性T细胞克隆的制备241

二、抗原非特异性T细胞克隆的制备242

三、鼠T细胞克隆的制备242

四、利用HLA／抗原肽四聚体和流式细胞分选仪制备CTL细胞克隆244

第二节 HLA／抗原肽四聚体制备技术246

一、HLA-I类分子单体的制备和纯化247

二、MHC-I单体的生物素化和纯化鉴定251

三、四聚体的制备及应用254

第十二章 噬菌体展示技术257

第一节 噬菌体展示技术基本原理257

一、噬菌体展示技术的应用原理257

二、噬菌体展示载体构建原理258

第二节 噬菌体展示技术筛选单链抗体258

一、噬菌体展示抗体库的构建258

第三节 噬菌体展示技术筛选多肽267

一、噬菌体肽库的构建267

二、筛选多肽267

三、噬菌体滴度的测定271

四、噬斑的扩增271

六、ELISA检测筛选到的靶分子结合肽272

五、测序模板的快速纯化272

七、影响筛选的因素274

第四节 噬菌体肽库的应用274

一、在生物活性小肽筛选方面的应用274

二、在抗原表位研究中的应用274

三、在人工抗体合成中的应用275

四、展望275

附录276

附录一 细胞爬片、甩片或切片的制备和固定276

附录二 蛋白质定量与凝胶染色278

附录三 常用蛋白酶和蛋白酶抑制剂281

附录四 常用发色底物283

附录五 Tris－甘氨酸SDS聚丙烯酰胺电泳凝胶的配制284

附录六 实验用小鼠的品系286

附录七 常用溶液的配制286