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引言1

酶活检测1

第一部分：高通量筛选6

第二部分：遗传选择7

第三部分：酶指纹分析9

其他领域中的酶活检测10

如何使用本书11

参考文献12

第一部分 高通量筛选12

1 根据颜色变化定量检测水解酶的活性和选择性17

1.1 概述17

1.2 用显色底物的直接检测法18

1.3 使用耦联反应的间接检测法——pH指示剂19

1.3.1 综述利用pH指示剂进行定量检测20

1.3.2 应用23

1.3.3 与其他方法对比26

1.4 选择性的估算和测定26

1.4.1 无参考化合物的选择性值的估算27

1.4.2 利用参考化合物定量测定选择性（Quick E及相关方法）29

1.4.3 应用32

1.4.4 优势与不足34

参考文献35

2 检测酶对映体选择性的高通量筛选体系37

2.1 引言37

2.2 基于紫外／可见光光谱的检测方法38

2.2.1 用手性对硝基苯酯的动力学拆分来筛选脂肪酶或酯酶的检测方法38

2.2.2 基于酶耦联的紫外／可见光的脂肪酶和酯酶检测40

2.2.3 酶法测定对映体过剩42

2.2.4 基于紫外／可见光的酶免疫测定作为测量对映体过剩的一种手段42

2.2.5 其他基于紫外／可见光的ee-检测方法43

2.3 使用荧光的检测方法43

2.3.1 基于伞形酮的体系43

2.3.2 用DNA微阵列进行荧光检测46

2.3.3 其他基于荧光的ee-检测方法46

2.4 基于质谱的检测方法48

2.4.1 使用同位素标记的MS检测方法48

2.5 基于核磁共振波谱的检测方法51

2.6 基于傅里叶转换红外光谱法的脂肪酶和酯酶检测方法55

2.7 基于气相色谱的检测方法58

2.8 基于HPLC的检测方法60

2.9 基于毛细管阵列电泳的检测方法61

2.10 基于圆二色光谱的检测方法63

2.11 基于表面增强共振拉曼散射的检测方法64

2.12 结论65

参考文献65

3 氧化还原酶的高通量筛选方法69

3.1 引言69

3.2 各种氧化还原酶的高通量方法69

3.2.1 脱氢酶69

3.2.2 氧化酶72

3.2.3 加氧酶76

3.2.4 漆酶80

3.3 小结81

参考文献82

4 检测方法的工业前景85

4.1 引言85

4.2 化学品定制中一个有效的生物催化剂筛选的先决条件87

4.3 基于光谱（紫外／可见光及荧光）的适用于CCM的筛选方法90

4.3.1 基于产物本身光谱性质的光谱方法90

4.3.2 基于产物连续转化的光谱法92

4.4 基于常规仪器检测的适应于CCM的筛选方法101

4.4.1 以流动-注射式NMR作为高通量筛选酶活的分析工具101

4.4.2 用于高通量筛选酶活的快速LC/MS方法109

4.5 结论115

参考文献116

第二部分 遗传选择116

5 基于琼脂平板的检测121

5.1 引言121

5.1.1 酶的定向进化：筛选或选择121

5.1.2 琼脂平板筛选的一般性质122

5.2 基于易化筛选的方法124

5.2.1 酰胺酶124

5.2.2 酯酶125

5.2.3 糖苷合成酶125

5.2.4 半乳糖氧化酶126

5.2.5 单胺氧化酶127

5.2.6 P450单加氧酶130

5.2.7 类胡萝卜素的生物合成132

5.2.8 生物素连接酶134

5.3 体内选择法135

5.3.1 糖苷合成酶135

5.3.2 预苯酸脱水酶／分支酸变位酶135

5.3.3 萜环化酶137

5.3.4 色氨酸的生物合成137

5.3.5 核糖醇脱氢酶138

5.3.6 内含肽138

5.3.7 氨酰-tRNA合成酶138

5.4 总结及展望140

参考文献140

6 酶编码基因的高通量筛选和选择142

6.1 引言142

6.2 高通量筛选和选择的基础143

6.3 用噬菌体展示对酶进行高通量选择143

6.4 用细胞展示对酶进行高通量选择146

6.5 体内遗传筛选及选择147

6.6 筛选异源蛋白的表达和稳定性147

6.6.1 引言147

6.6.2 异源表达的筛选方法149

6.6.3 异源表达的定向进化——近期实例151

6.7 体外区室化152

6.8 双乳液中的IVC154

6.9 总结评述156

参考文献156

7 化学互补160

7.1 引言160

7.2 互补检测法160

7.2.1 引言160

7.2.2 早期的互补检测法161

7.2.3 互补法进行酶学研究162

7.2.4 互补法进行定向进化164

7.3 化学互补法的发展166

7.3.1 引言166

7.3.2 三杂交检测法167

7.3.3 化学互补法173

7.4 化学互补法的应用178

7.4.1 引言178

7.4.2 酶-抑制剂相互作用178

7.4.3 糖苷合成酶的进化183

7.5 结论188

参考文献189

8 筛选新酶的分子途径192

8.1 引言192

8.2 在能培养的微生物中用核酸探针来探测编码酶的基因193

8.2.1 现有知识和应用194

8.2.2 探针技术的缺陷和创新方法的需求195

8.3 微生物的宏基因组：一个新的天然产物和酶的源泉196

8.3.1 获得不能培养的生物的多样性：生物群落DNA概念196

8.3.2 拆分代谢功能：BAC策略198

8.3.3 分析宏基因组文库：基于活性和基于序列的策略比较，特殊基因组的富集以及高通量筛选方法的应用200

8.3.4 宏基因组成果的延续203

8.4 总结评述204

参考文献205

第三部分 酶指纹分析205

9 解脂酶的荧光探针211

9.1 引言211

9.2 用于酶活检测的荧光底物212

9.2.1 三酰甘油脂肪酶的活性检测215

9.2.2 二酰甘油脂肪酶的活性检测217

9.2.3 胆固醇酯酶的活性检测218

9.2.4 磷脂酶的活性检测219

9.2.5 神经磷脂酶的活性检测221

9.3 用于活性酶定量分析和功能酶指纹分析的荧光抑制剂223

9.3.1 分析脂肪酶和酯酶223

9.3.2 探测酶的生物物理性质227

9.3.3 基于亲和性的蛋白质组图谱绘制230

参考文献234

10 水解酶的指纹分析方法238

10.1 引言238

10.1.1 一个酶一个底物240

10.1.2 酶活图谱241

10.1.3 鉴别微生物菌株的APIZYM系统242

10.2 水解酶的指纹分析245

10.2.1 用荧光和显色底物进行指纹分析245

10.2.2 用间接显色检测进行指纹分析250

10.2.3 鸡尾酒指纹分析253

10.3 用指纹数据进行分类255

10.3.1 指纹的表示255

10.3.2 数据的归一化258

10.3.3 酶指纹的等级聚类259

10.3.4 底物相似性的分析261

10.4 展望263

参考文献263

11 蛋白酶底物图谱266

11.1 引言266

11.2 功能性蛋白酶突破-肽底物文库267

11.2.1 基于溶液的肽底物文库268

11.2.2 基于固体支持物的肽文库的合成与筛选276

11.2.3 确定蛋白酶底物特异性的基因方法281

11.3 大分子底物的鉴定283

11.3.1 鉴定大分子底物的基因方法284

11.3.2 鉴定蛋白酶底物的蛋白质组学方法287

11.4 结论288

参考文献289

12 阵列上的酶活检测293

12.1 引言293

12.2 固定化策略294

12.2.1 共价和非共价固定化294

12.2.2 定点和非定点固定化295

12.2.3 肽链／小分子的定点固定化296

12.2.4 蛋白质的定点固定化297

12.3 检测酶活的微阵列方法302

12.3.1 用蛋白质阵列进行酶活检测303

12.3.2 用肽／小分子底物阵列进行酶活检测306

12.3.3 用其他阵列进行酶活检测314

12.4 结论316

参考文献316

中文索引321

英文索引328